TY  - THES
A1  - Loch, Sandra
T1  - Analyse des Inhibitionsmechanismus des varicelloviralen Faktors UL49.5
T1  - Analysis of the inhibitory mechanism of the varicelloviral factor UL49.5
N2  - Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
N2  - As an important strategy within the adaptive immune system, the major histocompatibility complex (MHC) class I-dependent pathway of antigen presentation can trigger the elimination of affected cells by cytotoxic T lymphocytes (CTL) upon presentation of antigenic peptides at the cell surface. A critical step is the translocation of peptides derived from proteasomal degradation into the ER-Lumen by the heterodimeric transporter associated with antigen processing (TAP). This process requires a macromolecular peptide-loading complex (PLC) comprising TAP, MHC I molecules and various chaperones and auxiliary factors. Especially herpes viruses, leading to lifelong persistence and repeated reactivation in the host, encode proteins which interfere at different steps with the MHC class I pathway, especially with the PLC. The varicellovirus protein UL49.5 employs a unique inhibition mechanism to suppress MHC class I expression on the cell surface, unknown from any other viral protein. It arrests the PLC in a functionally incompetent conformation and the protein from the bovine herpesvirus-1 (BHV-1) additionally targets components of the TAP-complex and the UL49.5 protein to proteasomal degradation, mediated by the C-terminal domain of the viral protein. The amino acid residues of UL49.5 which are responsible for TAP inhibition and degradation could not be deciphered yet. Therefore, the goal of this PhD thesis was to understand the mode of action of the BHV-1 UL49.5 protein and especially to analyze which regions of the protein are responsible for induction of the proteasomal degradation of the TAP-complex. The UL49.5 protein could be expressed successfully in Sf9 insect and HeLa cells. Using coimmunprecipitation studies, the binding of several UL49.5 variants to the PLC was analyzed in detail. These data were supported by an in vivo interaction screen (BiFC) and in vitro in rabbit reticulocyte lysate (RRL) translated UL49.5. The results of these studies showed that UL49.5 interacts in the absence of all components of the human immune system with both subunits of the TAP complex. Interestingly, UL49.5 binds both to the wildtype and to the coreTAP complex, consisting of the inner 6+6 transmembrane helices and the nucleotide-binding domains. Additionally, systematically truncated UL49.5 variants were generated to identify residues important for TAP inhibition and proteasomal degradation. Strikingly, neither the N-terminal nor the C-terminal domain of UL49.5 is required for binding to the TAP-complex, indicating that the transmembrane helix of UL49.5 mediates binding to TAP. Binding of the virus protein to the PLC seems to be mediated by the transmembrane domain of UL49.5. Using peptide transport assays, the inhibitory activity of UL49.5 mutants was characterized in detail. An assay using the fluorescence activated cell sorter (FACS) to rapidly analyze the effect of different UL49.5 variants on MHC class I expression on the cell surface was successfully established. In HeLa cells transiently transfected with UL49.5, a downregulation of MHC class I molecules was detected. After FACS sorting of these cells, a drastic reduction of the TAP-level was measured, which was dependent on proteasomal activity. Remarkably, after removal of two C-terminal amino acids of UL49.5, the protein could not induce proteasomal degradation of the TAP complex any more. The isolated C-terminal domain of UL49.5 was not able to induce proteasomal degradation any more, when it was transferred on other proteins. But also after deletion of ten N-terminal amino acids, the UL49.5 protein was drastically impaired in its inhibitory function. Therefore, the ER-luminal domain plays an important role within the process of TAP-inhibition and degradation. Taken together, a new immune evasion mechanism was identified for the BHV-1 UL49.5 protein. After binding of UL49.5 via its transmembrane domain to both subunits of the TAP-complex, the last C-terminal residues of UL49.5 induce the proteasomal degradation of the TAP-transporter. As a further important discovery, this ER-associated degradation signal strictly requires an upstream regulatory element in the ER-Lumenal domain of UL49.5, hence a signalling across the ER membrane. Within this new inhibitory mechanism, it was shown for the first time that additive elements of a small viral factor at two opposing sites of the ER membrane are essential for targeted degradation of a multi-subunit membrane complex.
KW  - Bovines Herpesvirus 1
KW  - Varizellen-Virus
KW  - MHC Klasse I
KW  - Herpesvirus
KW  - Varicellovirus
KW  - MHC
KW  - TAP
KW  - UL49.5
KW  - herpesvirus
KW  - varicellovirus
KW  - MHC
KW  - TAP
KW  - UL49.5
Y1  - 2009
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/6739
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30-68291
CY  - Frankfurt am Main
ER  -