TY  - THES
A1  - Wachtel, Carolin
T1  - Exploration of nilotinib enhancing the anti-leukaemic effects of Gas6 deletion in Ph+ B-ALL by inducing immunogenic cell death
N2  - Cancer is the major cause of death besides cardiovascular disease. Leukaemia represents the most prevalent malignancy in children with a frequency of 30 % and is one of the ten leading types of cancer in adults. Philadelphia Chromosome-positive B-ALL (Ph+ B-ALL) is driven by the cytogenetic aberration of the reciprocal chromosomal translocation t(9;22)(q34;q11) leading to the formation of the Philadelphia chromosome with a BCR-ABL1 fusion gene. This fusion gene encodes a BCR-ABL1 oncoprotein which is characterized by a constitutively enhanced tyrosine kinase activity promoting amplified proliferation, differentiation arrest and resistance to cell death. Ph+ B-ALL is considered the most aggressive ALL subtype with a long-term survival rate in the range of only 30 % despite intensive standard of care including chemotherapy in combination with a tyrosine kinase inhibitor (TKI) followed by allogeneic stem cell transplantation after remission for clinically fit patients. 
The efficacy of chemotherapy has long been mainly attributed to tumour cell toxicity while immune modulating effects have been overlooked, especially in light of known immunosuppressive properties. Accumulative evidence, however, emphasizes the ability of chemotherapeutic agents, including TKIs, to normalise or re-educate a dysfunctional tumour microenvironment (TME) resulting in enhanced anti-tumour immunity. One of the underlying mechanisms of immune modulation is the induction of immunogenic cell death (ICD). ICD is an anti-tumour agent-induced cell death modality determined by the capacity to convert cancer cells into anti-cancer vaccines. The induction of ICD relies on the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs) from dying tumour cells succumbing to ICD. Translocation of CALR to the cell surface, extracellular secretion of ATP and release of HMGB1 from the nucleus are key hallmarks of ICD that mediate anti-tumour immunity upon binding to antigen presenting cells resulting in a tumour antigen-specific immune response. Besides these molecular determinants, ICD is functionally defined by the inhibition of tumour growth in a vaccination assay in which mice are injected with tumour cells exposed to the potential ICD inducer in-vitro and then re-challenged with live tumour cells of the same cancer type. Both molecular and functional criteria determine the gold standard approach to assess ICD. By increasing the immunogenicity of cancer cells, ICD contributes to the restoration of immunosurveillance as an essential feature of tumour rejection, which is clinically reflected by improved therapeutic efficacy and disease outcome in patients. Therefore, identifying novel ICD inducers is an objective of interest in the context of cancer therapy.
In respect of these considerations, the aim addressed in the present work is the examination of the second-generation TKI Nilotinib for the ability to induce ICD. The thesis is set in the context of the group's research on the role of Gas6/TAM signalling within the TME regarding the pathogenesis of acute leukaemia. In        in-vivo experiments of our research group it has been consistently observed that the use of Nilotinib enhances the anti-leukaemic immunity mediated by a deletion of Gas6. Against the background of increasing importance of chemotherapeutic agents as potent modulators of a dysregulated TME, it was hypothesized that Nilotinib may synergize with a Gas6-deficient environment by inducing ICD in   Ph+ B-ALL cells. 
In growth inhibition and Annexin V/Propidium iodide cell death assays Nilotinib was shown to induce cell death in concentration-dependent manner that occurs bimodally in terms of cell death modality ranging between apoptosis and necrosis. By ICD marker analysis, comprising flow-cytometric detection of CALR exposure, chemoluminescence-based ATP measurement and immunoblotting for HMGB1, it was found that Nilotinib-induced cell death is not accompanied by CALR exposure and ATP secretion, but is associated with the release of HMGB1. In macrophages co-culture experiments with Nilotinib-treated leukaemic cells, no relevant shift in terms of macrophages activation and polarisation was observed in either a juxtacrine or paracrine setup. In consistency with the results obtained in the in-vitro experiments, Nilotinib was not potent to elicit a protective immune response in mice within a vaccination assay. 
Conclusively, Nilotinib was identified to not qualify as bona fide ICD inducer. The role of Nilotinib-induced cell death and HMGB1 release are proposed as objective for further investigation concerning the synergistic interplay between Nilotinib and a Gas6-deficient environment. Efforts addressing exploration and optimisation of the immunological potential of chemotherapeutic agents are a promising approach aimed at providing cancer patients with the best possible treatment in future.
N2  - Krebs stellt neben Herz-Kreislauf-Erkrankungen eine der Haupttodesursachen da. Leukämie ist mit einer Häufigkeit von 30 % die häufigste bösartige Erkrankung bei Kindern und gehört zu den zehn führenden Krebsarten bei Erwachsenen. Die Philadelphia-Chromosom-positive B-ALL (Ph+ B-ALL) wird durch die zytogenetische Aberration der reziproken chromosomalen Translokation t(9;22)(q34;q11) hervorgerufen, die zur Bildung des Philadelphia-Chromosoms mit einem BCR-ABL1-Fusionsgen führt. Dieses Fusionsgen kodiert ein BCR-ABL1-Onkoprotein, das durch eine konstitutiv erhöhte Tyrosinkinase-Aktivität zu verstärkter Proliferation, Differenzierungsblock und Resistenz gegenüber Zelltod führt. Ph+ B-ALL gilt als die aggressivste Form der ALL mit einer Langzeitüberlebensrate von lediglich 30 % trotz intensiver Chemotherapie, die in Kombination mit einem Tyrosinkinase Inhibitor (TKI) eingesetzt wird und welcher sich bei klinisch geeigneten Patienten nach Remission eine allogene Stammzelltransplantation anschließt.
Die Wirksamkeit von Chemotherapien wurde lange Zeit hauptsächlich der Toxizität gegenüber Tumorzellen zugeschreiben, wohingegen immunmodulierende Effekte insbesondere angesichts der bekannten immunsuppressiven Eigenschaften weitgehend unberücksichtigt blieben. Zunehmend zeigt sich jedoch, dass Chemotherapeutika, einschließlich TKI, eine dysfunktionale Tumormikroumgebung (TME) normalisieren oder umstrukturieren und somit eine verstärkte Antitumorimmunität bewirken können. Einer der zugrunde liegenden Mechanismen der Immunmodulation stellt die Induktion von immunogenem Zelltod (ICD) da. ICD ist eine Form des Zelltods, die dadurch charakterisiert ist, dass innerhalb der Tumortherapie abgetötete Krebszellen in Vakzinen gegen Krebs transformiert werden. Durch die Freisetzung von Damage Associated Molecular Patterns (DAMPs) aus sterbenden Tumorzellen wird ICD induziert, wobei die Translokation von CALR zur Zelloberfläche, die extrazelluläre Sekretion von ATP und die Freisetzung von HMGB1 aus dem Zellkern die zentralen Elemente des ICD darstellen und durch Bindung an antigenpräsentierende Zellen eine tumorantigenspezifische Immunantwort hervorrufen. Neben diesen molekularen Bestimmungsgrößen wird ICD funktionell über eine Inhibition des Tumorwachstums im Rahmen eines Impftests definiert, in welchem Mäuse lebenden Tumorzellen ausgesetzte werden, nachdem sie zuvor mit den als Vakzine fungierenden Krebszellen geimpft wurden. Zusammen bilden molekulare und funktionelle Kriterien den Goldstandard zur Beurteilung von ICD. Durch die Erhöhung der Immunogenität von Krebszellen trägt ICD zur Wiederherstellung der Immunüberwachung bei, die ein wesentliches Merkmal der Tumorabwehr ist und sich klinisch in einem verbesserten Behandlungsergebnis äußert. Daher stellt die Identifizierung von neuen ICD-Induktoren ein Ziel von Interesse im Hinblick auf Behandlungsstrategien von Krebs dar.
Unter Berücksichtigung dieser Aspekte, ist die Untersuchung des TKI Nilotinib hinsichtlich seiner Fähigkeit, ICD zu induzieren, das Anliegen der vorliegenden Arbeit. Diese steht im Kontext der Forschungsarbeiten der Arbeitsgruppe zur Rolle der Gas6/TAM-Achse innerhalb des TME bei der Entstehung von akuten Leukämien. In den in-vivo-Experimenten unserer Forschungsgruppe wurde konsistent beobachtet, dass der Einsatz von Nilotinib die durch die Deletion von Gas6 vermittelte antileukämische Immunität verstärkt. Vor dem Hintergrund der zunehmenden Bedeutung von Chemotherapeutika als potente Modulatoren eines dysregulierten TME wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass Nilotinib mit einer Gas6-defizienten Umgebung durch die Induktion von ICD in Ph+ B-ALLZellen synergistisch wirken könnte.
In Wachstumshemmungs- und Annexin V/Propidiumiodid-Zelltod-Assays konnte gezeigt werden, dass Nilotinib konzentrationsabhängig Zelltod induziert, welcher in Bezug auf die Zelltodmodalität bimodal apoptotisch und nekrotisch verläuft. Mittels ICD-Markeranalyse, die den durchflusszytometrischen Nachweis der Translokation von CALR, die Chemolumineszenz basierte ATP-Messung und das Immunoblotting für HMGB1 umfasst, wurde festgestellt, dass der durch Nilotinib induzierte Zelltod nicht mit einer CALR-Translokation oder ATP-Sekretion einhergeht, aber mit der Freisetzung von HMGB1 assoziiert ist. In Makrophagen-Co-Kultur-Experimenten mit Nilotinib behandelten leukämischen Zellen wurde weder in einem juxtakrinen noch in einem parakrinen Versuchsaufbau eine relevante Veränderung bezüglich der Makrophagenaktivierung und -polarisation beobachtet. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der in-vitro Experimente konnte Nilotinib im Rahmen des Impftests keine schützende Immunantwort in Mäusen hervorrufen
Zusammenfassend wurde herausgearbeitet, dass Nilotinib nicht als Induktor von ICD eingestuft werden kann. Aspekte des Nilotinib induzierten Zelltods und der HMGB1-Freisetzung werden als Gegenstand weiterer Untersuchungen bezüglich des synergistischen Zusammenspiels zwischen Nilotinib und einer Gas6-defizienten Umgebung vorgeschlagen. Bemühungen um die Erforschung und Optimierung des immunologischen Potenzials von Chemotherapeutika stellen einen vielversprechenden Ansatz dar, um Krebspatienten in Zukunft die bestmögliche Behandlung zukommen zu lassen.
Y1  - 2020
UR  - http://publikationen.ub.uni-frankfurt.de/frontdoor/index/index/docId/61402
UR  - https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hebis:30:3-614020
CY  - Frankfurt am Main
ER  -