C. Deutsche Zusammenfassung
Genetische Information wird von Desoxyribonukleinsäuren (DNS) in Boten-Ribo-nukleinsäuren (mRNS) kopiert (Transkription), welche wiederum am Ribosom in Proteine übersetzt wird (Translation). Das Ribosom setzt sich aus einer großen und kleinen Untereinheit zusammen, bestehend aus ribosomaler RNS (rRNS) und Proteinen. Im Zwischenraum der beiden Untereinheiten wird die mRNS gebunden und mittels aminoacylierter Transfer-RNS (tRNS) übersetzt. Die Aminosäuren im Protein werden durch Tripletts von Nukleobasen in der mRNS (Codons) und Anti-Codons auf der tRNS dekodiert. Im Peptidyl-Transfer-Zentrum der großen Untereinheit wird dabei das naszierende Peptid um jeweils eine weitere Aminosäure kovalent erweitert (Elongation) und bleibt während der gesamten Übersetzung an der tRNS gebunden. Am Ende der Translation wird das Protein von der tRNS abgelöst. Dazu wird das Stop-Codon durch proteinogene Entlassungsfaktoren (release factor, eRF1 und -3) erkannt und die Peptid-tRNS-Bindung hydrolysiert (Termination). Im Anschluss bindet das ATP-binding cassette (ABC) Protein E1 (ABCE1) an den Entlassungsfaktor im terminierten Ribosom (Prä-Spaltungskomplex) und katalysiert die Spaltung der ribosomalen Untereinheiten, die für eine weitere Translationsrunde zur Verfügung stehen. ABCE1 ist aus zwei Nukleotid-Bindedomänen (NBD1 und -2) aufgebaut, die komplementär zwei Nukleotid-Bindestellen (NBS I und II) formen. ABCE1 enthält eine N terminale Eisen Schwefel (FeS)-Cluster-Domäne. Durch Dimerisierung der beiden NBDs werden zwei Nukleosidtriphosphate eingeschlossen. Die dabei entstehende mechanische Energie aus der Dimerisierung wird an assoziierte Domänen übertragen, die mit dem Ribosom wechselwirken. Wenn die mRNS vor dem Stop-Codon geschnitten wird oder eine stabile Sekundärstruktur aufweist, führt dies zu einem mechanischen Anhalten der mRNS-Translation und es werden Kontrollprozesse des no-go decay eingeleitet zum Abbau von fehlerhafter mRNS, naszierendem Protein oder sogar assoziierter Faktoren. Der nicht-kanonische Entlassungsfaktor Pelota erkennt die angehaltenen ribosomalen Komplexe. ABCE1 kann analog zum Entlassungsfaktor auch an Pelota binden und spaltet das Ribosom. Die Peptid-tRNS wird bei den Kontrollprozessen nicht hydrolysiert, bleibt nach dem Spalten des Ribosoms in der großen Untereinheit verankert, und dient als Erkennungsmarker für die Markierung des naszierenden Peptids mit Ubiquitin für den proteasomalen Abbau.
Für die Rekonstitution von in vitro Spaltungsexperimenten wurden in der Bäckerhefe spaltungskompetente Ribosomen als Substrat für ABCE1 in vivo programmiert angehalten und gereinigt. Durch Expression einer Reporter-mRNS mit selbst-prozessierenden 3’ Ribozym wurde die mRNS in vivo geschnitten und translatierende Ribosomen an dieser angehalten. Das Recycling der angehaltenen Ribosomen konnte durch das genetische Entfernen des Entlassungsfaktors Pelota (Dom34) verhindert und der angehaltene Zustand angereichert werden. N-terminal kodierte die mRNS für eine Polyhistidin-Markierung zur Affinitätsreinigung der angehaltenen ribosomalen Komplexe. Als Reporter für das kodierte Protein auf der mRNS wurde das grün fluoreszierende Protein (GFP) genutzt, welches zugleich als fluoreszierender Marker im naszierenden Protein diente. Das Spaltungsexperiment selbst war im Green Labor etabliert worden und gründet auf der Analyse von ribosomalen Untereinheiten durch native Gelelektrophorese. Hierbei beruhte die Detektion auf radioaktiv markiertem Peptid an der tRNS. Dieser Ansatz wurde genutzt für die Analyse der in vivo angehaltenen Ribosomen mittels Fluoreszenzdetektion via GFP-Reporter am naszierenden Protein und an der kleinen ribosomalen Untereinheit im nativen Polyacrylamid-Gel. Das in vitro rekonstituierte Spalten der angehaltenen Ribosomen erfordert neben dem Spaltungsfaktor ABCE1, den nicht-kanonischen Entlassungsfaktor Dom34 (in der Bäckerhefe) und den Antiassoziationsfaktor eIF6, der die Reassoziation der ribosomalen Untereinheiten nach dem Spalten verhindert. Das Spalten der in vivo angehaltenen Ribosomen wurde durch Zugabe von ABCE1/Dom34/eIF6 und Adenosintriphosphat (ATP) etabliert. Das naszierende Protein GFP verblieb dabei an der tRNS gebunden und in der großen ribosomalen Untereinheit verankert.
Die Funktion von eIF6 wurde in einem Anti-/Reassoziationsansatz überprüft, in welchem die ribosomalen Untereinheiten dissoziieren und wieder assoziieren abhängig von der Kalium- und Magnesium-Konzentration. Bindet jedoch der Antiassoziationsfaktor eIF6 an die große Untereinheit, wird das Reassoziieren verhindert und die resultierenden ribosomalen Untereinheiten können mittels Sukrose-Dichtegradientenzentrifugation getrennt werden. Der Anti /Reassoziationsansatz wurde benutzt zur Überprüfung der Interaktion von ABCE1 mit der kleinen ribosomalen Untereinheit. Die ATP abhängige Interaktion wurde durch Verwenden des nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP stabilisiert. Mithilfe diesen Ansatzes konnte der Komplex zwischen ABCE1 und der kleinen ribosomalen Untereinheit in vitro rekonstituiert werden, der formal den Post-Spaltungskomplex darstellt. 
Die Struktur des Post-Spaltungskomplexes aus der Bäckerhefe wurde mit Hilfe der Kryo-Elektronenmikroskopie (EM) in Zusammenarbeit mit der Beckmann Gruppe (Genzentrum, LMU, München) rekonstruiert. Die Präparationsmethode des Post-Spaltungskomplexes mittels Anti-/Reassoziation der Ribosomen erlaubte eine starke Anreicherung von ABCE1 an der kleinen ribosomalen Untereinheit und ermöglichte das Erzielen einer Auflösung von 3,9 Å in der Rekonstruktion. Zum ersten Mal konnte die Position der FeS-Cluster-Domäne an der kleinen ribosomalen Untereinheit nach dem Spalten lokalisiert werden, welche in eine Tasche zwischen Helix 44 und uS12 bindet. Die Domäne muss zwischen dem Prä- und Post-Spaltungskomplex eine deutliche Drehung um ca. 150° vollziehen. Die NBDs von ABCE1 liegen als geschlossenes dimerisiertes ABC-System vor, das in den beiden NBS jeweils ein Nukleotid aufweist. Neben der veröffentlichten offenen Konformation des ABC-Systems im freien Zustand und der halb-geschlossenen Konformation im Prä-Spaltungskomplex ist die Konformation von ABCE1 im Post-spaltungskomplex voll-geschlossen mit zwei gebundenen Nukleotiden in den NBS. Insgesamt konnten zahlreiche Interaktionen identifiziert werden, die den Post-Spaltungskomplex stabilisieren. So wird der Arm zwischen der NBD1 und der FeS-Cluster-Domäne über Arginin 7 an der Helix 5 der rRNS fixiert. Prolin 30 der FeS-Cluster-Domäne bildet eine Interaktionsbrücke zu Isoleucin 52 von uS12 aus, Serin 150 stabilisiert die Helix-Loop-Helix-Domäne der NBD1 an der rRNS Helix 15. Arginin 573, sowie Serin 588 interagieren mit der rRNS Helix-Verbindung 8/14. Weiterhin konnte eine Brücke zwischen Glutamin 262 zum C-Terminus von eS24 identifiziert werden. 
In Zusammenarbeit mit Peter Kötter (Institut für Molekulare Biowissenschaften, Goethe-Universität, Frankfurt/M.) wurde ein Plasmid Shuffling Assay entwickelt, der es erlaubt das essenzielle Wildtyp-Gen von ABCE1 durch ein mutiertes ABCE1*-Gen zu ersetzen. Die Überlebensfähigkeit des Stammes konnte so in Abhängigkeit des mutierten Gens bestimmt werden. In vivo wurde mithilfe des Shuffling Assays bestätigt, dass die interagierenden Reste Arginin 7 und Tyrosin 301 bei einer Doppelmutation letal sind. 
Die hier gewonnenen Erkenntnisse erlauben Rückschlüsse auf den Spaltungsmechanismus von ABCE1. So muss die FeS-Cluster-Domäne zwangsläufig auf ihrer Rotationstrajektorie mit dem Entlassungsfaktor kollidieren und diesen wie einen Keil zwischen die beiden ribosomalen Untereinheiten drücken, der dabei das Ribosom spaltet. In der finalen Position konnte eine mutmaßliche Kollision der FeS-Cluster-Domäne mit uL6 der großen ribosomalen Untereinheit identifiziert werden, die das Blockieren der Reassoziation der beiden Untereinheiten in der Präparation und nach dem Spalten durch ABCE1 erklärt.
Weiterhin konnte in Zusammenarbeit mit der Beckmann Gruppe eine niedrig-aufgelöste Dichtekarte des Post-Spaltungskomplexes in Archaeen rekonstruiert werden. Diese zeigt die FeS-Cluster-Domäne in der gleichen Position wie in der Bäckerhefe. Zur Rekonstitution wurden katalytisch inhibierte Varianten von ABCE1 benutzt, die von Elina Nürenberg-Goloub (Institut für Biochemie, Goethe-Universität, Frankfurt/M.) charakterisiert wurden. Diese nehmen den geschlossenen Zustand ohne Zugabe von AMP-PNP ein und das Aufheizen auf 80-100 °C entfällt, was der physiologischen Temperatur des Organismus S. solfataricus entspricht. In Plasmid Shuffling Studien in S. cerevisiae konnte gezeigt werden, dass Mutationen katalytischer Reste der NBS II größtenteils letal sind, wohingegen Mutationen in der NBS I toleriert werden. Dies spricht für einen regulatorischen Prozess in ABCE1, in dem die NBS II eine Kontrollfunktion und die NBS I die Spaltungsfunktion übernimmt. Dies steht auch in Übereinstimmung mit der Struktur des Post-Spaltungskomplexes, in der die Position der FeS-Cluster-Domäne über die NBS I stabilisiert wird. 
Die Spaltung des Ribosoms durch ABCE1 ist in der Literatur als ATP-hydrolyse abhängig beschrieben. Nicht-hydrolysiertes AMP-PNP konnte jedoch im Post-Spaltungskomplex identifiziert werden, der die Momentaufnahme der Spaltung selbst darstellt. Diese Diskrepanz kann in Übereinstimmung gebracht werden, wenn angenommen wird, dass ABCE1 mehrmals schließt bis eine Spaltung des Ribosoms stattfindet. Diese Annahme deckt sich auch mit den Beobachtungen der Stimulation der ATPase beim Spalten. Folglich muss es in ABCE1 einen regulatorischen Mechanismus geben, der möglicherweise durch das Ribosom geschaltet wird und dabei die ATPase der NBS I stimuliert. Voraussetzung ist dabei das Schließen der NBS II.
Mithilfe der 3,9 Å-Struktur des Post-Spaltungskomplexes wurde eine niedrig-aufgelöste Dichtekarte von ribosomalen Initiationskomplexen mit gebundenem ABCE1 rekonstruiert. ABCE1 nimmt hier die gleiche Konformation wie im Post-Spaltungskomplex an. Zusätzlich war die kleine ribosomale Untereinheit mit Initiationsfaktoren (eIF) und einer Initiator-tRNS besetzt. Diese Beobachtung erlaubt es zum ersten Mal den Zyklus der Translation strukturell zu schließen. Bisher konnte noch keine direkte Interaktion zwischen ABCE1 und den Initiationsfaktoren identifiziert werden. Diskutiert wird eine Interaktion zu eIF3 und dessen b g i Untereinheit. Die FeS Cluster-Domäne könnte dabei eine Brücke zwischen eIF3 und der kleinen ribosomalen Untereinheit bilden. Interessanterweise bindet die FeS-Cluster-Domäne aber an eine Position der Helix 44, die auf der gegenüberliegen Seite einen Knick aufweist. Vor kurzem wurde publiziert, dass genau an dieser Stelle die γ Untereinheit von eIF2 beim Erkennungsvorgang des Start-Codons durch Initiator-tRNS bindet. Zusammengefasst ergibt dies, dass ABCE1 in der Post-Spaltungskonformation Initiationsfaktoren auch über die Wechselwirkung mit der rRNS beeinflussen könnte, insbesondere im Bereich der Helix 44. Ein weiterer Ansatz sieht vor, dass ABCE1 die Re-Initiation durch Kollision der FeS-Cluster-Domäne an der Helix 44 mit der WH Domäne des Re-Initiationsfaktors eIF2D blockiert. Es ergeben sich folglich zahlreiche Szenarien, in denen ABCE1 unterstützend oder unterdrückend auf die Initiation wirken könnte, oder sogar beides, und damit die Funktion einer ATP-hydrolyse bestimmten Zeitschaltuhr übernimmt.
Zur Bestimmung der konformationellen Dynamik von ABCE1 in Echtzeit wurde ein System auf Einzelmolekül-basiertem Förster-Resonanzenergietransfer (smFRET) etabliert. Das Bäckerhefe ABCE1 wurde zur Detektion von FRET mit fluoreszierenden Proben an Cystein-Paaren markiert. Die zusätzlich vorhandenen Cysteine außerhalb der FeS-Cluster-Domäne mussten dazu ersetzt werden durch Aminosäuren ohne freie Thiolgruppen. Nachträglich wurden Cystein-Paare für die Fluoreszenzmarkierung mittels Maleimid-Kupplung eingesetzt. Die Positionen der Cystein-Paare für die Abstandsbestimmungen zwischen den NBS I und II waren bereits von Kristin Kiosze-Becker (Institut für Biochemie, Goethe-Universität, Frankfurt/M.) im archealen System charakterisiert worden. Zusätzlich wurde eine weitere Variante benutzt für die Abstandsbestimmung zwischen der FeS-Cluster-Domäne und der NBD1. Die Zell-Viabilität dieser Varianten wurde in Plasmid Shuffling Studien belegt und Bindungsstudien an der kleinen ribosomalen Untereinheit bestätigten die Aktivität und Nutzbarkeit der fluoreszenzmarkierten Varianten. In Kollaboration mit Philipp Höllthaler (Institut für Biochemie, Goethe-Universität, Frankfurt/M.) wurden die Doppel-Cysteinvarianten mit Fluoreszenz-Donor (sCy3)  und -Akzeptor (sCy5)-Proben markiert und an einer Glasoberfläche immobilisiert. In einem alternierenden Laseranregungs-smFRET-Aufbau konnte die Donor- und Akzeptor-Fluoreszenz ausgelesen und die FRET-Effizienz bestimmt werden. Die FRET-Effizienz ist zum relativen Abstand der Donor- und Akzeptor-Proben anti-korreliert. Mithilfe der summierten Abstandsverteilung wurden konformationelle Populationen identifiziert. In Abhängigkeit der kleinen ribosomalen Untereinheit sowie verschiedener Nukleotide wurde dynamisches Verhalten für alle drei Varianten beobachtet. Es konnte bestätigt werden, dass die beiden NBS durch Zugabe von ATP und AMP-PNP schließen und die FeS-Cluster-Domäne rotiert, wie in der Struktur des Post-Spaltungskomplexes beobachtet. Dieses System erlaubt die Bestimmung der Verweildauer und der konformationellen Dynamiken von ABCE1 mit Substraten bei Raumtemperatur. Hierbei können Rückschlüsse auf die zeitliche Abfolge der inneren Bewegungstrajektorien des ABC-Systems geschlossen werden. Interaktionspartner für ABCE1 könnten in Zukunft spaltungskompetente Ribosomen oder Initiationskomplexe sein. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die beiden NBS in Anwesenheit von AMP-PNP und der kleinen ribosomalen Untereinheit öffnen und schließen. Zudem konnte deutlich schnelleres Öffnen und Schließen der beiden NBS beobachten werden, als dies die bestimmte ATPase Rate vorgab. Dies erlaubt das Aufstellen der Hypothese einer elastischen konformationellen Dynamik und Dimerisierung der NBDs in ABC-Systemen, die abhängig ist von Interaktionspartnern und Nukleotiden, aber nicht unmittelbar zur ATP-Hydrolyse führt.

D. Abstract
Translation is a universal process in all kingdoms of life and organized in a cycle that requires ribosomal subunits (40S and 60S), messenger RNA (mRNA), aminoacylated transfer RNAs (tRNAs), and a myriad of regulatory factors. As soon as translation reaches a stop codon or stalls, a termination or surveillance process is launched via release factors eRF1 or Pelota (Dom34), respectively. The ATP-binding cassette (ABC) protein ABCE1 interacts with release factors at the ribosomal A-site and coordinates the recycling process in Eukarya and Archaea. Two asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) control and execute the ribosome splitting upon dimerization and closure of the two nucleotide-binding domains (NBDs). 
Ribosome nascent chain complexes (RNCs), ABCE1, and Dom34 from S. cerevisiae were produced for the reconstitution of splitting assays in order to probe for ABCE1’s actions in the splitting process with its native substrate. Translating ribosomes were stalled in vivo in a no-go situation on truncated mRNAs by a 3´-ribozyme motif that generates truncated mRNAs. The initiated decay mechanisms were circumvented by genomic deletion of the release factor Dom34 (Pelota) of the no-go decay machinery. The mRNA coded for an N terminal affinity purification tag (His-tag) and the green fluorescent protein (GFP) as a reporter of the translated nascent chain in the ribosomal complexes. RNCs were successfully in vivo stalled, enriched, and purified. In native gels, the reconstituted splitting experiments were analyzed by separation of RNCs, ribosomal subunits, and nascent chain-tRNA complexes based on the fluorescence readout of the GFP reporter. In addition, the anti-association factor eIF6 was added in the splitting reaction because it blocks the immediate re-association of ribosomal subunits after splitting. The anti-association activity of eIF6 was probed by an anti-/re-association assay, in which ribosomes are anti-associated by high salt and low magnesium conditions and in a second step re-associated. The re-association can be blocked by binding of eIF6 and other anti-associating factors to the ribosomal intersubunit sites. This approach allowed for the discovery of an anti-association activity of ABCE1 that was dependent on the non-hydrolysable ATP analog AMP-PNP. In addition, the formed complex between 40S and ABCE1 represented formally a post-splitting intermediate. 
In collaboration with the Beckmann lab, the structure of the post-splitting complex was reconstructed at 3.9 Å. The ABC system of ABCE1 is fully closed and its N-terminal iron-sulfur (FeS) cluster domain is rotated by 150-degree to a cleft at helix 44 and uS12. The FeS cluster domain is stabilized by interactions of Pro30 to uS12, Arg7 to helix 5, and the cantilever arm that links it to NBD1. Tyr301 of NBD1 stabilizes the FeS cluster domain in the rotated position by interaction to the backbone of the cantilever arm. Upon transition to the post-splitting state, the FeS cluster domain must clash with the release factor and push it in between the ribosomal subunits like a wedge and split the ribosome. In addition, in the post-splitting state, the FeS cluster domain would putatively clash with uL14 of the large ribosomal subunit, and this is the structural explanation for the anti-association effect of ABCE1. In Archaea, a similar conformation of the post-splitting complex was reconstructed in collaboration with the Beck and Beckmann labs and Kristin Kiosze-Becker and Elina Nürenberg-Goloub. Based on the high-resolution structure of the post-splitting complex, the post-splitting state of ABCE1 was identified in the 43S initiation complex 40S–ABCE1–tRNA–eIF2–eIF3. Subsequently, we proposed the post-splitting complex as a platform for initiation.
In the quest to elucidate conformational dynamics of ABCE1, a reconstituted system was established to study conformational dynamics in real-time. Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) was used for the relative distance detection between a donor and acceptor fluorophore. A cysteine-less ABCE1 variant was engineered with additional cysteines for fluorescent labeling by thiol-maleimide-coupling. In collaboration with Philipp Höllthaler, the double-cysteine variants were labeled for smFRET studies and alternating-laser excitation (ALEX) smFRET measurements were performed with ABCE1 and the small ribosomal subunit. ABCE1’s nucleotide-dependent NBD dimerization and FeS cluster domain rotation was determined in real-time. Finally, a higher opening and closing frequency of the NBDs was discovered than the determined ATPase rate. This observation could be explained by the hypothesis of elastic dimerization that is not immediately connected to ATP hydrolysis.