Open Access

Jelena Farac

• Präkallikrein spielt als Kontaktphasenprotein eine wichtige Rolle in der endogenen Aktivierung der Blutgerinnung. Ein hereditärer Präkallikreinmangel ist sehr selten und wird meist wegen der Unauffälligkeit bezüglich einer Blutungsneigung nur zufällig aufgrund einer verlängerten aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) festgestellt. In der vorliegenden Arbeit wurde die genetische Variabilität des Präkallikrein-Gens bei PK-Mangel-Patienten sowie in der Normalbevölkerung untersucht. Für die Untersuchungen wurde zunächst die DNA einer phänotypisch unauffälligen Kontrollgruppe bestehend aus 200 gesunden Blutspendern auf Genvariationen im PKGen analysiert. Nach der Isolierung und der Amplifikation der DNA wurde mit sämtlichen Proben zunächst ein Mutations-Screening mittels dHPLC durchgeführt. Auffällige Abschnitte und solche, bei denen häufige und/oder mehrere Polymorphismen bereits bekannt waren, wurden sequenziert. Auf diese Weise wurden neun Polymorphismen in den kodierenden bzw. die Exone flankierenden Genabschnitten nachgewiesen. Davon wurden drei (c.-438G>A; c.490-5T>C; c.689T>A) erstmals beschrieben. Nach der Untersuchung der Normalbevölkerung wurde eine Genanalyse bei sieben Patienten mit einem stark ausgeprägten PK-Mangel durchgeführt. Insgesamt wurden dabei sechs verschiedene Mutationen nachgewiesen, davon zwei Missense-Mutationen, eine Nonsense-Mutation, zwei kleine Deletionen und eine kleine Insertion. Zwei dieser Mutationen wurden bereits in der Literatur beschrieben, die vier weiteren wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals aufgezeigt. Da insgesamt bisher in der Literatur lediglich fünf unterschiedliche Mutationen des Präkallikrein-Gens beschrieben wurden, erhöht sich die Anzahl der bekannten Präkallikreingendefekte durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf das nahezu Doppelte. Eine der Mutationen (c.689T>A, p.Ile230Asn) wurde auch bei einem Blutspender nachgewiesen. Da es sich um eine hochkonservierte Aminosäure handelt und durch die Mutation eine neue N-Glykosilierungsstelle in dem Protein generiert wird, ist eine Beeinträchtigung der Proteinfunktion sehr wahrscheinlich. Allerdings kann erst nach weiteren funktionellen Untersuchungen ausgeschlossen werden, dass es sich um einen seltenen, für die Proteinfunktion wenig bedeutenden Polymorphismus handelt. Somit sind zusammengefasst zwei Aspekte in dieser Arbeit behandelt worden. Zum einen wurde der Frage nach dem Ausmaß der natürlich vorkommenden genetischen Variabilität des Präkallikrein-Gens nachgegangen, zum anderen wurde der Versuch unternommen, Sequenzvarianten zu finden, die verantwortlich sind für die phänotypische Variabilität bei PK-Mangel. Beide Fragestellungen sind von grundsätzlichem Interesse für die biomedizinische Forschung. Möglicherweise wird es damit dann möglich sein, Krankheitsentstehungen und ihre Verläufe besser zu verstehen und damit eine noch effektivere und nebenwirkungsärmere Therapie einzusetzen.
• Prekallikrein as a protein of the contact phase plays a significant role in the intrinsic pathway of blood coagulation. A hereditary PK deficiency is very rare and as it causes no abnormal bleeding it is mostly diagnosed accidently, because of a prolongation of aPTT. In this study the genetic variability of the PK gene was examined in patients suffering from PK deficiency and in healthy subjects. First it was important to analyze the DNA of the phenotypical inconspicuous control group, which consists of 200 healthy blood donors regarding the genetic variants in the PK gene. After isolation and amplification of the DNA all the samples were screened by the dHPLC. Conspicious regions and samples of genes with several and/or common polymorphisms have been sequenced. In that way nine polymorphisms were found in the coding regions and in regions close-by the exons. Three of them (c.-438G>A; c.490- 5T>C; c.689T>A) were first described in this study. After examining the healthy subjects the genetic variability of the PK gene in seven patients suffering from PK deficiency was analysed. All in all six different mutations could be proved. Two of them were missense mutations, one nonsense mutation, two small deletions and one small insertion. Two of which were known from literature before, the other four were described for the first time. As a matter of fact, merely five different mutations of the PK gene have been described in literature. Consequently, with the results of this study the number of the known mutations nearly doubles. One of the described mutations (c.689T>A, p.Ile230Asn) was also proved in the control DNA of one blood donor. As the amino acid is conserved and as the mutation generates a motif for the n-glycolization in the protein, it is probable that this mutation causes an effect on the protein function. Though, to exclude the possibility that this variant is a rare polymorphism without effect on the phenotype more functional analysis is necessary. So, in this study two different aspects have been discussed. First the natural genetic variability of the prekallikrein gene has been treated. Afterwards we tried to specify gene variants, which seem to be responsible for the phenotypical variability in PK deficiency. Both of the questions will certainly be of interest for the future biomedical research. Maybe it will be possible to get to know more about the development and the progress of diseases in order to find a more effective therapy with less adverse effects.