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Robin Klimek

• The most versatile tool for visualizing endogenous RNA is molecular beacons (MBs). MBs are modified oligonucleotides that consist of a stem-loop structure equipped with a fluorophore and a quencher at the opposite ends. They only give a fluorescent signal when hybridized to the target RNA. Here we present our recent efforts to enhance the spatiotemporal resolution of RNA visualization by refining MBs. We first asked if we could refine MBs to visualize defined subcellular populations of RNA in living neurons. To achieve this, we utilize visible light-activatable Q-dye MBs to allow only a subcellular fraction to be activated. Here, the fluorophore at the 5’-end was linked to a second quencher via a photolabile coumarin protecting group. Therefore, the MB only gives a fluorescent signal, when activated with visible light and hybridized to the target. This architecture allowed local activation of a hybridized subpopulation in a defined area of the cell. Knowing the exact origin of the activated RNA, we were able to increase the available monitoring time for neuronal mRNA from several minutes (literature known MBs) to more than 14 hours. We next asked if it would be possible to gain spatiotemporal control over where the MB hybridization events occur. Therefore, we developed photo-tethered MBs where two phosphates in the loop backbone are covalently linked to each other via two photocages. This prevents the MB from hybridization to the target RNA. Only when light is applied, the photo-tethers are cleaved, and the inherent hybridization function of the MB is activated. This architecture allowed us to control the hybridization of photo-tethered MBs in primary cultured neurons.
• In den vergangenen Jahrzehnten war RNA das Forschungsobjekt unzähliger Universitäten und Pharmaunternehmen weltweit. Doch auch die breite Bevölkerung ist mit der Zulassung der mRNA basierten COVID-19 Impfstoffe mit dem Aufbau und der Wirkweise von Nukleinsäuren in Berührung gekommen. Viele Wissenschaftler gehen davon aus, dass RNA in Zukunft eine immer größere Rolle in der Medizin und der Behandlung von Krankheiten spielen wird. Doch nicht nur die Entwicklung von therapeutischen Oligonukleotiden ist von großem Interesse. Um die unzähligen Wirkungsmechanismen von Nukleinsäuren zu verstehen, ist noch immer viel Grundlagenforschung nötig. Dabei ist es zum Beispiel wichtig zu verstehen, wo Nukleinsäuren in der Zelle hergestellt werden, wohin sie transportiert werden und wie sie am Ankunftsort regulatorisch wirken. Da DNA und RNA mit bloßem Auge nicht sichtbar ist, wurden in den vergangenen Jahren viele Werkzeuge und Methoden entwickelt, um sie sichtbar zu machen. Neben Protein-basierten Methoden (MS2, Pepper, dCas3), Fluorophor-Aptamer Paaren (Mango, Spinach, Broccoli) und Fluorophor-Quencher Paaren (SRB-2, Riboglow) haben sich vor allem molecular beacons als Werkzeug für die RNA-Visualisierung etabliert. Gegenüber den zuvor genannten Methoden haben Sie den großen Vorteil, dass sie nicht nur zur Visualisierung exogener synthetischer, sondern auch von endogener RNA geeignet sind.