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Dario Piano

• Photosystem II (PSII) is a polypeptide-cofactor complex organised as a homodimeric multisubunit protein embedded in the thylakoid membrane. PSII monomers are heterooligomers related to each other by a pseudo-twofold axis perpendicular to the membrane plane (Loll et al. 2005). PSII acts as a photochemical enzyme that through the chlorophylls and the other cofactors catalyses photon capture and electron transfer from water to the plastoquinone pool with concomitant evolution of oxygen. Photon capture and charge separation take place in the PSII core which consists of the D1 and D2 proteins, the cytochrome b559 alpha- and beta-chains (PsbE and F subunits) and the chlorophyll a-binding antenna proteins CP43 and CP47 (Loll et al. 2005). The remaining polypeptides are low molecular mass proteins with not clearly understood fuctions; they include chloroplast-encoded (PsbH, I, J, K, L, M, N, T and Z) and nucleus-encoded (PsbR, S, W and X) proteins consisting of one to four transmembrane helices (Barber et al. 1997). The oxygen-evolving part of PSII consists of a Mn-Ca transition complex called Mn cluster or oxygen evolving complex that is situated on the luminal side of PSII. In higher plants it is stabilised by the PsbO (33 kDa), PsbP (23 kDa) and PsbQ (17 kDa) extrinsic subunits (Soursa et al. 2006; Ifuku et al. 2005). The structure and mechanisms related to the oxygen evolving complex of PSII are not completely clarified. Currently two high resolution structures from the cyanobacteria S. elongatus are available (Loll et al. 2005; Ferreira et al. 2004) Nevertheless structural information is not as well defined in green algae and higher plants as in cyanobacteria. In fact the 8Å structure available from spinach has too low resolution for addressing questions such as the structural and functional differences in respect to PSII from cyanobateria (Rhee et al. 1997).. Therefore it is obvious that for PSII from higher plants the main general questions are still open: is the structure of PSII from higher plants equivalent to the structures observed in cyanobacteria? Is the typical higher plants subunit PsbS stably or transiently bound to PSII? Finding an answer to these questions was the main focus of this work. In this work a simple and rapid protocol to isolate the oxygen-evolving photosystem II (PSII) core complex from Nicotiana tabacum was developed. A PSII having a His-tag extension made of six or ten consecutive histidine residues at the N-terminus of the PsbE subunit was purified by a single-step Ni2+ NTA-affinity column chromatography after solubilisation of the thylakoid membranes using different mild detergents. Characterization of the oxygen evolution and the subunit composition by immunoblotting and mass spectroscopy revealed that the His-tagging did not affect the functional integrity of the PSII reaction center. The final PSII core complex was purified in a single step from solubilised thylakoids in less than 14 hours getting a very pure sample in high amount. The isolated core complex was in a dimeric form as demonstrated by Blue Native PAGE, analytical gel filtration and single particles analysis; with a molecular mass of about 500 kDa, consisting of D1, D2, CP43, CP47, 33 kDa and low molecular weight proteins. The preparation retains a high rate of oxygen-evolving activity but showed different stabilities of the binding of the three extrinsic proteins. The subunit of 33 kDa was always present in the preparations with a constant amount, whereas the 23 and 17 kDa subunits were always in less and unconstant amounts. Nevertheless the oxygen evolution was not depending on the amount of the 23 and 17 kDa subunits. Furthermore the preparation showed a high oxygen-evolving activity of 1390 micromol/mg Chl·h-1 in presence of betaine, while its activity was 440-680 micromol/mg Chl·h-1 in its absence. The presence of 1.0 mol/L betaine during the isolation of PSII increased the preservation of the photochemical activity hence the oxygen evolution. It was inferred from these results that His-tagging does not affect the functional and structural integrity of the PSII core complex and that the “Histag strategy” is highly useful for biochemical, physicochemical and structural studies of higher plant PSII. PSII is directly involved in two essential processes, the efficient capture and funnelling of light energy to the reaction centre and the controlled dissipation of excess excitation energy. Those functions require structural and functional flexibility in order to be performed with high efficiency. Moreover light-harvesting proteins respond to an external signal, the thylakoid pH, to induce feedback control regulating those activities in every moment. This process called non-photochemical quenching (NPQ) is mainly depending on the xanthophyll cycle and the PsbS protein (Szabo et al. 2005). In this work several new evidences related with those two processes were found. The subunit PsbS is a polypeptide whose involvement in the NPQ processes is debated. Nevertheless, its position in the PSII complex and the mechanisms by which this subunit contributes to carry out the NPQ functions are not definitely known. In addition it is not sure if it is a pigment binding protein or not. Currently several lines of evidence indicate that this subunit is able to bind two molecules of zeaxanthin, one of the pigments involved in the xanthophyll cycle. In this work immunolabelling indicated that PsbS is tightly bound to the PSII core dimer, monomer and incomplete PSII particles as Reaction Centre-CP47 (RC-CP47). Furthermore qualitative HPLC indicates a complete absence of zeaxanthin in the sample and the presence of violaxanthin, another pigment involved in the xanthophyll cycle. The absence of zeaxanthin was expected considering that the plants were harvested after the dark period and that the particles were purified in complete dark (or in green light), whereas the presence of violaxanthin was unexpected considering that so far no evidence of violaxanthin bound to PSII cores devoid of LHC proteins was reported. Furthermore the amount of chlorophyll b was not relevant for suspecting this pigment bound to PsbS. Therefore we conclude that if PsbS is able to bind chlorophyll it has to be a chlorophyll a. The results indicate that PsbS could be able to bind not only zeaxanthin but also violaxanthin. The extrinsic subunit Psb27 was also found in this preparation. The presence and the amount of this subunit, reported to be involved in the repair of damaged PSII, was not constant and therefore behaving as the other two extrinsic proteins 23kDa (PsbP) and 17kDa (PsbQ). Electron crystallography studies on spinach PSII particles purified by differential solubilisation resulted in crystalline tubes with new unit cell constants. From data analysis a density map at 15Å resolution was obtained with a P22121 symmetry. However, at this resolution it cannot be said if the internal symmetry axis is related with the two-fold axis of the dimer or the pseudo two-fold axis of the monomer. In conclusion a method to isolate functional, pure PSII core complexes was developped. These samples, together with the improved 2d crystallisation protocol could lead to crystals with higher quality hence better resolution density maps in the future.
• Photosystem II (PSII) ist ein Polypeptid-Kofaktor-Komplex, dessen Untereinheiten als Homodimer organisiert vorliegen und in höheren Pflanzen in den Granabereichen der Thylakoidmembran eingebettet sind. PSII Monomere wiederum bestehen aus Hetero-Oligomeren, die pseudo-symmetrisch um eine Achse positioniert sind, welche rechtwinklig zur Membranebene steht (Loll et al. 2005). PS II agiert als photochemisch aktives Enzym, das mit Hilfe der gebundenen Chlorophylle Photonen einfängt und unter Beteiligung weiterer Kofaktoren einen Elektronenfluss von Wasser zu Plastochinon betreibt. Dabei wird gleichzeitig molekularer Sauerstoff frei gesetzt. Die primäre Ladungstrennung findet nach Absorption eines Photons im PSII Kern statt, welcher sich aus den Untereinheiten D1, D2, den alpha- und beta-Untereinheiten von Cytochrom b559 (PsbE und PsbF) sowie den Chlorophyll a-bindenden Kernantennen CP47 und CP43 zusammensetzt (Loll et al. 2005). Bei den übrigen Polypeptiden des Photosystems II handelt es sich um niedermolekulare Proteine, deren Funktion in vielen Fällen noch nicht geklärt ist. Einige dieser Untereinheiten werden im Chloroplasten kodiert (PsbE, F, H, I, J, K, L, M, N, T und Z) während andere im Nukleus kodiert werden (PsbR, S, W und X). Im Allgemeinen bilden sie eine bis vier transmembrane Helices (Barber et al. 1997). Der Teil des Photosystems II, der für die Spaltung von Wasser zuständig ist, besteht aus einem Mn4-Ca Übergangskomplex. Dieser ist im Thylakoidlumen lokalisiert und wird Wasser spaltender oder Sauerstoff bildender Komplex genannt. In höheren Pflanzen wird er durch die extrinsischen Untereinheiten PsbO (33 kDa), PsbP (23 kDa) und PsbQ (17 kDa) stabilisiert (Soursa et al. 2006; Ifuku et al. 2005). Weder die Struktur dieses Komplexes noch der Reaktionsmechanismus der Wasserspaltung konnten bisher vollständig aufgeklärt werden. Zurzeit existieren zwei Strukturen mit hoher Auflösung von Photosystem II, welches aus dem Cyanobakterium Synechococcus elongatus isoliert wurde (Loll et al. 2005; Ferreira et al. 2004). Nichtsdestotrotz bleibt eine Reihe von Fragen unbeantwortet, vor allem in Bezug auf die Funktion und Position der kleineren Untereinheiten des PS II, die in den Strukturdaten nicht ausreichend bestimmt werden konnten, sowie in Bezug auf den definitiven Wasserspaltungsmechanismus (Loll et al. 2005; Ferreira et al. 2004). Da für Grünalgen und höhere Pflanzen bisher keine Strukturen mit hoher Auflösung verfügbar sind (Rhee et al. 1997), bleiben einige der wichtigsten Fragen weiterhin offen. Ist die Struktur des Photosystems II höherer Pflanzen tatsächlich äquivalent zur Struktur des Photosystems II der Cyanobakterien? Ist die für höhere Pflanzen typische PsbS Untereinheit stabil an Photosystem II gebunden oder interagiert sie mit den Lichtsammelkomplexen? Die Beantwortung dieser Fragen bildete den Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Aufreinigungsprotokolle für Photosystem II aus höheren Pflanzen sind mit einigen Nachteilen verbunden, vor allem in Bezug auf Verunreinigungen durch Photosystem I und LHCII (Light harvesting complex II), die Verwendung starker Detergenzien und die im Vergleich zu thermophilen Organismen geringe Stabilität des Photosystems II. Die bestehenden Protokolle für die Aufreinigung von Photosystem II mittels differentieller Zentrifugation oder Saccharosedichtezentrifugation resultieren entweder in Proben geringer Reinheit oder haben zumindest den Nachteil, auf spezielle, später schwer zu entfernende Detergenzien angewiesen zu sein. Für diese Arbeit wurde deshalb ein Protokoll zur schnellen Isolierung von Sauerstoff bildenden PSII Kernkomplexen aus Nicotiana tabacum entwickelt. Mit Hilfe von sechsfachem oder zehnfachem Histidin-tag am N-Terminus der PsbE Untereinheit war es möglich Photosystem II, nach Solubilisierung der Thylakoidmembranen durch milde Detergenzien, durch Ni-NTA Chromatographie in einem Schritt zu präparieren. Die Bestimmung der Sauerstoffbildungsraten und die Zusammensetzung der Proteinuntereinheiten belegten hierbei, dass die funktionelle Integrität der PSII Reaktionszentren erhalten blieb. Im Endeffekt konnten so signifikante Mengen von hoch reinen PSII Kernkomplexen mit nur einem Aufreinigungsschritt aus solubilisierten Thylakoidmembranen innerhalb von höchstens vierzehn Stunden isoliert werden. Mit Hilfe von Blue Native PAGE, analytischer Gelfiltration, Massenspektroskopie, immonologischem Nachweis und Single Particle Analyse konnte demonstriert werden, dass die isolierten Komplexe mit einer Größe von circa 500 kDa in dimerer Form vorlagen und sich aus den Untereinheiten D1, D2, CP47, PsbO (33 kDa Protein) und einer Reihe niedermolekularer Proteine zusammensetzten. Das auf diese Art und Weise präparierte Photosystem II zeichnete sich durch eine hohe maximale Sauerstoffbildungsaktivität aus, mit Raten bis zu 1800 mikromol O2 / (mg Chl • h). Diese PSII Komplexe zeigten ein sehr konstantes Mengenverhältnis von PsbO (33 kDa Protein), während die beiden anderen Untereinheiten des Sauerstoffbildenden Komplexes (PsbP & PsbQ) in schwankenden Mengen auftraten. Nichtsdestotrotz zeigte sich, dass die maximalen Sauerstoffbildungsraten nicht von den Mengen an PsbP und PsbQ in der Probe abhängig waren, sondern dass vielmehr das Vorhandensein bestimmter Reagenzien während der Isolation einen maßgeblichen Einfluss hatten. Tatsächlich zeigten die PSII Komplexe eine hohe Sauerstoffbildungsrate von 1390 mikromol O2 / (mg Chl • h) in der Anwesenheit von Betain, während die Aktivität ohne Betain nur 440 bis 680 mikromol O2 / (mg Chl • h) betrug, auch wenn in beiden Fällen die künstlichen Elektronenakzeptoren Kaliumhexacyanoferrat und 2,6-Dichloro-p-benzochinon in der Reaktionslösung vorhanden waren. Die deutlichste Erhöhung der Sauerstoffbildungsraten wurde durch die Verwendung von 1,0 mol/l Glycinbetain während der Aufreinigung von Photosystem II erreicht. Zusammengenommen konnte also festgestellt werden, dass trotz der Einführung des His-tags Photosystem II strukturell intakt bleibt und dass sich daher diese His-PSII Komplexe sehr gut für biochemische, physikochemische und strukturelle Untersuchungen am Photosystem II höherer Pflanzen eignen. Photosystem II ist direkt an zwei essentiellen Vorgängen der Lichtreaktionen beteiligt. Zum einen sammelt Photosystem II Lichtenergie und leitet diese gezielt zum Reaktionszentrum weiter und zum anderen sorgt es dafür, dass überschüssige Anregungsenergie sicher abgeleitet werden kann. Die Vorraussetzungen für eine hohe Effizienz dieser Funktionen sind funktionelle und strukturelle Flexibilität. Des Weiteren bestehen Kontrollmechanismen darin, dass die Lichtsammelkomplexe (LHCII) auf äußere Signale, wie zum Beispiel den pH-Wert des Thylakoidlumens reagieren können. Das heißt, es existiert eine effiziente Feedbackkontrolle zur Steuerung der Menge an Anregungsenergie, die tatsächlich dem Reaktionszentrum zugeführt wird. Wichtige Funktionen im Abbau überschüssiger Lichtenergie (nicht-photochemisches Quenching, NPQ) werden hierbei durch den so genannten Xanthophyllzyklus und das PsbS Protein übernommen (Szabo et al. 2005). In dieser Arbeit wurden einige neue Informationen in Bezug auf diese beiden Prozesse erarbeitet. Es ist zwar bekannt, dass die viel diskutierte PsbS Untereinheit eine Rolle im NPQ Mechanismus spielt, allerdings sind weder die genaue Position noch die tatsächlichen Funktionen dieses Proteins bisher geklärt worden. Darüber hinaus ist es weiterhin unklar, ob es sich bei PsbS um ein pigmentbindendes Protein handelt. Zurzeit existieren mehrere Belege, dass die PsbS Untereinheit in der Lage ist zwei Moleküle Zeaxanthin, welches ein Pigment des Xanthophyllcyclus darstellt, zu binden (Szabo et al. 2005). Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass PsbS stabil an PSII Kerndimere, PSII Kernmonomere und unvollständige PSII Partikel, wie die RC47 Komplexe (CP47 + Reaktionszentrum), gebunden ist. Darüber hinaus konnte in qualitativen Pigmentbestimmungen mittels HPLC kein Zeaxanthin, aber stattdessen Violaxanthin, ein weiteres Pigment des Xanthophyllzyklus, in den genannten PSII Komplexen nachgewiesen werden. Die Abwesenheit von Zeaxanthin entspricht insofern den Erwartungen, dass die Pflanzen am Ende der Dunkelperiode geerntet und die PSII Komplexe in völliger Dunkelheit oder unter grünem Licht präpariert wurden. Die Anwesenheit von Violaxanthin war allerdings unerwartet, da es bis zum jetzigen Zeitpunkt noch keinen Hinweis darauf gab, dass Violaxanthin an PS II bindet. Somit ist dies der erste Hinweis für ein Vorkommen von Violaxanthin in PSII Kernkomplexen. Des Weiteren war die Menge an Chlorophyll b in den Proben so gering, dass man davon ausgehen kann, dass PsbS - wenn es denn überhaupt Chlorophylle bindet - ausschließlich Chlorophyll a bindet. Zusammengenommen lässt dies den Schluss zu, dass PsbS sowohl Violaxanthin als auch Zeaxanthin binden kann, das heißt der gesamte Xanthophyllcyclus kann mit Hilfe der PsbS Untereinheit abgewickelt werden. Es gilt außerdem zu beachten, dass in den durchgeführten PSII Präparationen auch die extrinsische Psb27 Untereinheit gefunden und mittels Massenspektrometrie eine erste Charakterisierung vorgenommen wurde. Allerdings waren das Vorhandensein und die Mengen an Psb27, welches vermutlich eine Rolle im Reparaturzyklus von beschädigten PSII Komplexen in vivo spielt, in den PSII Proben nicht konstant wie das auch für die ebenfalls extrinsischen Untereinheiten PsbP (27 kDa Protein) und PsbQ (17 kDa Protein) der Fall war. PSII Partikel, die mittels differentieller Solubilisierung und Dichtegradientenzentrifugation aus Spinat isoliert wurden, konnten für 2D Kristallisationsexperimente verwendet und elektronenmikroskopisch untersucht werden. Es zeigten sich röhrenartige Kristalle, die sich durch vollkommen neuartige Einheitszellenkonstanten auszeichneten. Die Analyse der Kristalle wurde für das Erstellen einer Dichtekarte mit einer Auflösung von 15 Å und einer Raumgruppe von P22121 herangezogen. Die ermittelte Dichtekarte zeigt eine interne Symmetrieachse, allerdings ist es bei dieser Auflösung nicht möglich eine Aussage darüber zu treffen, ob es sich hierbei um die Symmetrieachse des PSII Dimers oder die pseudo-symmetrische Achse des Monomers handelt. Abschließend lässt sich feststellen, dass die bestehenden Protokolle für die Kristallisation von PSII aus Spinat durchaus verbessert werden können und sich damit Dichtekarten mit höherer Auflösung erreichen lassen. Diese verbesserten Protokolle können nun für Kristallisationsversuche mit His-tag PSII aus Tabak herangezogen werden, um mit diesen hochreinen Präparationen die Auflösung nochmals zu verbessern.