Open Access

Srinivas Allanki

• The two diametrically opposing outcomes after tissue damage are regeneration and fibrotic scarring. After injury, adult mammals predominantly induce fibrotic scarring, which most often leads to patient lethality. Fibrotic scarring is the deposition of excessive extracellular matrix that matures and hinders tissue function. The scarring response is mainly orchestrated by myofibroblasts, which arise only upon tissue damage, from various cellular origins, including tissue resident fibroblasts, endothelial cells and circulating blood cells. On the contrary, species like zebrafish, possess the remarkable capacity to regenerate their damaged tissues. After injury, instead of inducing a myofibroblast-mediated fibrogenic gene program, cells in these species undergo regenerative reprogramming at the transcriptional level to activate vital cellular processes needed for regeneration, including proliferation, dedifferentiation, and migration. Several pro-regenerative mechanisms have been identified to date. Most of them, if not all, are also important for tissue homeostasis and hence, are not injury specific. Therefore, the central aim of this study is to identify injury-specific mechanisms that not only induce regeneration, but also limit fibrotic scarring. To test the notion that fibrotic scarring limits regeneration, I first compared the scarring response in the regenerative zebrafish heart after cryoinjury with what is known in the non-regenerative adult mouse heart. I found that zebrafish display ~10-fold less myofibroblast differentiation compared to adult mouse after cardiac injury. With these findings, I hypothesized that zebrafish employ mechanisms to actively suppress scarring response. Using a novel comparative transcriptomic approach coupled with genetic loss-of-function analyses, I identified that Interleukin-6 (Il-6) cytokine family-mediated Stat3 is one such pro-regenerative pathway in zebrafish. Il-6 cytokine family consists of Il-6, Interleukin-11 (Il-11), Ciliary neurotrophic factor, Leukemia inhibitory factor, Oncostatin M, and Cardiotrophin-like cytokine factor 1. Il-6 family ligands signal through their specific receptors and a common receptor subunit (Il6st or Gp130). Using gene expression analyses after adult heart and adult caudal fin injuries in zebrafish, I identified that both the Il-11 cytokine encoding paralogous genes (il11a and il11b) are the highest expressed and induced among the Il-6 family cytokines. Hence, I chose Il-11 signaling as a candidate pathway for further analysis. To investigate the role of Il-11 signaling, I generated genetic loss-of-function mutants for both the ligand (il11a and il11b) and the receptor (il11ra) encoding genes. Using various tissue regeneration models across developmental stages in these mutants, I identified that Il-11/Stat3 signaling is indispensable for global tissue regeneration in zebrafish. To investigate the cellular and molecular mechanisms by which Il-11 signaling promotes regeneration, I performed transcriptomics comparing the non-regenerative il11ra mutant hearts and fins with that of the wild types, respectively. I identified that Il-11 signaling orchestrates both global and tissue-specific aspects of regenerative reprogramming at the transcriptional level. In addition, I also found that impaired regenerative reprogramming in the il11ra mutant hearts and fins resulted in defective cardiomyocyte and osteoblast repopulation of the injured area, respectively. On the other hand, by deep phenotyping the scarring response in il11ra mutant hearts and fins, I identified that Il-11 signaling limits myofibroblast differentiation. Furthermore, I found that cardiac endothelial cells and fibroblasts are one of the major responders to injury-induced Il-11 signaling. Using lineage tracing, I found that both the endothelial and fibroblast lineages in the non-regenerative il11ra mutants commit to a myofibroblast fate, spearheading the scarring response. In addition, using cell type specific manipulations, I showed that Il-11 signaling in cardiac endothelial cells allows cardiomyocyte repopulation of the injured area. Finally, using human endothelial cells in culture, I uncovered a novel feedback mechanism by which Il-11 signaling limits fibrogenic gene expression by inhibiting its parent activator and a master regulator of tissue fibrosis, TGF-β signaling. Overall, I identified Interleukin-11/Stat3 signaling as the first global regulator of regeneration in zebrafish. Briefly, I showed that Interleukin-11 signaling promotes regeneration by regulating two crucial cellular aspects in response to injury – (1) it promotes regenerative reprogramming, thereby allowing cell repopulation of the injured area and (2) it limits mammalian-like fibrotic scarring by inhibiting myofibroblast differentiation and TGF-β signaling. Altogether, these zebrafish data, together with the contradicting mammalian data strongly indicate that the secrets of tissue regeneration lie downstream of IL-11 signaling, in the differences between regenerative and non-regenerative species. Furthermore, I establish the non-regenerative il11ra mutant as an invaluable zebrafish model to study mammalian tissue fibrosis.
• Die beiden diametral entgegengesetzten Ergebnisse nach einer Gewebeschädigung sind Regeneration und fibrotische Vernarbung. Nach einer Verletzung kommt es bei erwachsenen Säugetieren überwiegend zu einer fibrotischen Narbenbildung, die in den meisten Fällen zum Tod des Patienten führt. Fibrotische Narbenbildung ist die Ablagerung von übermäßiger extrazellulärer Matrix, die reift und die Gewebefunktion behindert. Die Vernarbungsreaktion wird hauptsächlich von Myofibroblasten gesteuert, die nur bei einer Gewebeschädigung aus verschiedenen Zellen entstehen, darunter gewebeeigene Fibroblasten, Endothelzellen und zirkulierende Blutzellen. Im Gegensatz dazu besitzen einige Arten wie der Zebrafisch die bemerkenswerte Fähigkeit, ihr geschädigtes Gewebe zu regenerieren. Nach einer Verletzung induzieren die Zellen dieser Spezies kein myofibroblastenvermitteltes fibrogenes Genprogramm, sondern sie werden auf transkriptioneller Ebene regenerativ umprogrammiert, um lebenswichtige zelluläre Prozesse zu aktivieren, die für die Regeneration erforderlich sind, darunter Proliferation, Dedifferenzierung und Migration. Bislang wurden mehrere pro-regenerative Mechanismen identifiziert. Die meisten von ihnen, wenn nicht alle, sind auch für die Gewebehomöostase wichtig und daher nicht verletzungsspezifisch. Daher besteht das Hauptziel dieser Studie darin, verletzungsspezifische Mechanismen zu identifizieren, die nicht nur die Regeneration einleiten, sondern auch die fibrotische Narbenbildung begrenzen. Um zu prüfen, ob die fibrotische Vernarbung die Regeneration einschränkt, habe ich zunächst die Vernarbungsreaktion im regenerativen Zebrafischherz nach einer Kryoverletzung mit dem verglichen, was über das nicht regenerative erwachsene Mausherz bekannt ist. Ich fand heraus, dass Zebrafische im Vergleich zu erwachsenen Mäusen nach einer Herzverletzung eine etwa 10-fach geringere Myofibroblasten-Differenzierung aufweisen. Aufgrund dieser Ergebnisse stellte ich die Hypothese auf, dass Zebrafische Mechanismen zur aktiven Unterdrückung der Vernarbungsreaktion einsetzen. Mithilfe eines neuartigen vergleichenden transkriptomischen Ansatzes in Verbindung mit genetischen Loss-of-Function-Analysen konnte ich feststellen, dass das durch die Interleukin-6 (Il-6)-Zytokinfamilie vermittelte Stat3 ein solcher pro-regenerativer Signalweg im Zebrafisch ist. Die Il-6-Zytokinfamilie besteht aus Il-6, Il-11, Cntf, Lif, Osm und Clcf1. Die Liganden der Il-6-Familie signalisieren über ihre spezifischen Rezeptoren und eine gemeinsame Rezeptoruntereinheit (Il6st oder Gp130). Anhand von Genexpressionsanalysen nach Verletzungen des adulten Herzens und der adulten Schwanzflosse bei Zebrafischen habe ich festgestellt, dass die beiden für Il-11 kodierenden paralogen Gene (il11a und il11b) unter den Zytokinen der Il-6-Familie am stärksten exprimiert und induziert werden. Daher wählte ich den Il-11-Signalweg als Kandidaten für eine weitere Analyse aus. Um die Rolle des Il-11-Signalwegs zu untersuchen, habe ich Funktionsverlustmutanten sowohl für die Liganden- (il11a und il11b) als auch für die Rezeptor- (il11ra) kodierenden Gene erzeugt. Anhand verschiedener Modelle zur Geweberegeneration in verschiedenen Entwicklungsstadien dieser Mutanten konnte ich feststellen, dass der Il-11/Stat3-Signalweg für die globale Geweberegeneration im Zebrafisch unerlässlich ist. Um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, durch die der Il-11-Signalweg die Regeneration fördert, führte ich transkriptomische Untersuchungen durch und verglich die nicht regenerativen Herzen und Flossen der il11ra-Mutanten mit denen der Wildtypen. Ich stellte fest, dass der Il-11-Signalweg sowohl globale als auch gewebespezifische Aspekte der regenerativen Reprogrammierung auf der Transkriptionsebene steuert. Darüber hinaus stellte ich fest, dass eine gestörte regenerative Reprogrammierung in den Herzen und Flossen der il11ra-Mutanten zu einer mangelhaften Wiederbesiedlung des verletzten Bereichs mit Kardiomyozyten bzw. Osteoblasten führt. Andererseits konnte ich durch eine tiefgreifende Phänotypisierung der Vernarbungsreaktion in den Herzen und Flossen der il11ra-Mutanten feststellen, dass der Il-11-Signalweg die Myofibroblasten-Differenzierung begrenzt. Darüber hinaus stellte ich fest, dass kardiale Endothelzellen und Fibroblasten zu den Hauptakteuren gehören, die auf die verletzungsinduzierte Il-11-Signalisierung reagieren. Mithilfe von Lineage-Tracing habe ich herausgefunden, dass sowohl die Endothel- als auch die Fibroblastenlinien in den nicht-regenerativen il11ra-Mutanten ein Myofibroblasten-Schicksal annehmen und die Narbenbildung induzieren. Darüber hinaus konnte ich durch zelltypspezifische Manipulationen zeigen, dass der Il-11-Signalweg in kardialen Endothelzellen die Wiederbesiedlung des verletzten Bereichs mit Kardiomyozyten ermöglicht. Schließlich habe ich unter Verwendung menschlicher Endothelzellen in Kultur einen neuartigen Rückkopplungsmechanismus aufgedeckt, durch den der Il-11-Signalweg die fibrogene Genexpression begrenzt, indem er den Hauptaktivator und -regulator der Gewebefibrose, den TGF-β-Signalweg, hemmt. Insgesamt habe ich den Interleukin-11/Stat3-Signalweg als ersten globalen Regulator der Regeneration im Zebrafisch identifiziert. Kurz gesagt habe ich gezeigt, dass der Interleukin-11-Signalweg die Regeneration fördert, indem er zwei entscheidende zelluläre Aspekte als Reaktion auf eine Verletzung reguliert - (1) er fördert die regenerative Reprogrammierung und ermöglicht dadurch die Wiederbesiedlung des verletzten Bereichs mit Zellen, und (2) er begrenzt die säugetierähnliche fibrotische Narbenbildung, indem er die Myofibroblasten-Differenzierung und den TGF-β-Signalweg hemmt. Insgesamt deuten diese Zebrafischdaten zusammen mit den widersprüchlichen Säugetierdaten stark darauf hin, dass die Geheimnisse der Geweberegeneration in den Unterschieden zwischen regenerativen und nicht-regenerativen Spezies Downstream der IL-11-Signalgebung liegen. Darüber hinaus habe ich die nicht-regenerative il11ra-Mutante als wertvolles Zebrafischmodell zur Untersuchung der Gewebefibrose bei Säugetieren etabliert.