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Selective expansion of GP 91 phox gene-modified murine haematopoeitic stem cells

Selektive Expansion von GP91-phox-Gen-modifizierten murinen hämatopoetischen Stammzellen

  • Haematopoietic stem cells (HSCs) are regarded as the prime target for gene therapy of inherited and acquired disorders of the blood system, e.g. X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD). The major reason for this is that HSCs posses the ability to self renew as well as the potential to differentiate into all lineage-specific cell types. However, the need to reach and to maintain sufficient therapeutic levels of genetically modified stem cells and their progeny after gene delivery still presents major challenges for current HSC gene therapy approaches. In particular, one of the main limitations for most genetic defects is the lack of a selective growth advantage of gene-modified cells after engraftment. In vitro and in vivo methods have been developed that focus on either positive or negative selection of HSCs. An artificial selection advantage can be conferred to transduced HSCs by incorporating a selection marker in addition to the therapeutic transgene. In the present study, two novel strategies for positive selection of murine gp91phox gene-modified haematopoietic stem cells were developed and tested, bearing in mind that with selective growth advantage, the possibility of uncontrolled proliferation arises. The first strategy to be investigated was based on the homeobox transcription factor HOXB4, which plays an important role in the control of haematopoietic stem cell proliferation and differentiation. Overexpression of a retroviral bicistronic construct containing the therapeutic gene gp91phox and HOXB4 in murine primary bone marrow cells led to a significant 3–4-fold expansion of transduced cells ex vivo. The numbers of transgene-expressing cells increased 2–3-fold after 2 weeks cultivation under cytokine stimulation. Furthermore, the clonogenic progenitor cell assay (CFU assay) demonstrated that the number of colony-forming cells had increased to levels 2-fold higher than those of mock-transduced cells after 1 week of culture, thereby augmenting the presence of a significant number of stem/progenitor cells in the selected cell population. However, in our experiments, HOXB4-overexpressing murine HSCs did not show any repopulating advantage in transplanted recipient mice over control construct-transduced HSCs. These results indicate that selective expansion of gp91phox gene-modified HSCs can be induced by the HOXB4 transcription factor ex vivo but not in vivo. This is possibly dependent on HOXB4 expression levels, which are too low in vivo to achieve selection. The second strategy made use of a chemically inducible dimerizer system consisting of the therapeutic gene gp91phox and a fusion protein, containing sequences from a growth factor receptor signalling domain (epidermal growth factor receptor, EGFR, or prolactin receptor, PrlR) and the drug binding protein FKBP12, as the selection cassette. This strategy aimed to allow inducible selection that could be easily switched off. The activity of these fusion proteins is controlled through the small molecular dimerizer AP20187. Transduction of BaF/3 cells with lentiviral vectors expressing the EGFR construct induced proliferation and led to complete selection within 18 days (99%). However, removing AP20187 could not turn off proliferation. This construct is, therefore, not suitable as a selection cassette for the expansion of gene-modified HSCs due to its oncogenic potential. Transduction of the construct containing the intracellular domain of PrlR caused significant selective expansion of AP20187-treated BaF/3 cells. Following expression in cells, the fusion protein, which lacks membrane-anchoring sequences, mainly localized to the cytoplasm. Evidence was found to indicate that activated STAT5 might be responsible for this effect. Upon expression of the prolactin construct, phosphorylation of STAT5 and its DNA-binding activity to a ß-casein promoter sequence was strongly increased. Importantly, the induced proliferation was reversible after removal of AP20187. Transduced Sca1+ bone marrow cells obtained from C57BL/6-CD45.1 mice could be expanded about 20–100-fold ex vivo in the presence of AP20187 and mSCF without losing progenitor cell features and the capability to contribute to all lineages of the haematopoietic system. To exclude oncogenic outgrowth of one single clone, the polyclonality of selected cells was proven by ligation-mediated PCR (LM-PCR) analysis. In mouse transplantation experiments, ex vivo-expanded cells repopulated the bone marrow of lethally irradiated mice suggesting that the ex vivo expansion took place at the level of haematopoietic stem and/or progenitor cells. Genomic gp91phox sequences were detected in the bone marrow, spleen and peripheral blood cells of transplanted animals, indicating that gp91phox-containing cells most likely contributed to the reconstitution of haematopoiesis in these mice.
  • Stammzellen stellen die entscheidenden Zielzellen bei Gentherapie-Strategien zur Behandlung von erworbenen und angeborenen Krankheiten des Blutsystems, wie zum Beispiel der X-chromosomal vererbten chronischen Granulomatose, dar. Diese Stammzellen können später in alle verschiedenen Blutzellreihen differenzieren und gleichzeitig den Stammzellpool erhalten (Selbsterneuerung). Allerdings bereitet es immer noch große Probleme, eine genügend große Anzahl dieser Stammzellen genetisch zu modifizieren. Dies stellt eines der Hauptprobleme aktueller Gentherapie Studien dar. Des weiteren bedeutet der Gentransfer vieler therapeutischer Gene für die Zelle kein Vorteil in Bezug auf das Zellwachstum, nachdem sich die gen-modifizierten und transplantierten Zellen im Körper angesiedelt haben. Ein zusätzliches Selektions-Molekül könnte der Zelle einen Proliferationsvorteil verschaffen und so zur Expansion der wenigen gen-modifizierten Zellen führen. In der vorliegenden Arbeit wurden für eine selektive Expansion von genetisch modifizierten murinen hämatopoetischen Stammzellen zwei neue Selektionssysteme entwickelt. In der ersten Strategie wurde die Funktion des intrinsischen Transkriptionsfaktors HOXB4 genutzt, der eine zentrale Rolle in Zellvermehrung und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen spielt. Zunächst wurde ein bicistronisches gammaretrovirales Vektorkonstrukt, bestehend aus dem therapeutischen Gen gp91phox und HOXB4, kloniert. Wachstumskurven haben gezeigt, dass die Überexpression dieses retroviralen Vektors in murinen hämatopoetischen Stammzellen ex vivo in einem signifikanten 3 bis 4-fachen Zellzahl-Anstieg resultierte. Die FACS-Analyse dieser Zellen hat ergeben, dass, nach zwei Wochen unter Stimulation mit den Stammzellzytokinen IL-6, IL-3 und SCF, die Anzahl der gp91phox Transgen exprimierenden Zellen ebenfalls 2 bis 3-fach anstieg. Des weiteren zeigt der auf Methylcellulose basierende Colony forming units (CFU) - Assay, dass die Anzahl der koloniebildenden Zellen nach einer Woche auf das zweifache anstieg, verglichen mit Kontroll-Vektor transduzierten Zellen. Dies belegt eine signifikante Anzahl an Stamm- und/oder Vorläuferzellen in der selektierten Zellpopulation. Allerdings haben diese selektionierten Zellen nicht die Fähigkeit, in bestrahlte, myeloablatierte Empfängermäuse transplantiert das hämatopoetische System wieder aufzubauen. Der prozentuale Anteil der gp91phox exprimierenden Zellen im Knochenmark dieser Mäuse betrug 8 bis 10 Wochen nach Transplantation deutlich weniger als 5%. Diese Ergebnisse belegen, dass gp91phox Gen-modifizierte hämatopoetische Stammzellen zwar ex vivo mittels Überexpression von HOXB4 selektioniert und vermehrt werden können, in vivo aber keinen Vorteil gegenüber nicht modifizierten Zellen besitzen. Möglicherweise beruht diese Diskrepanz auf einem zu niedrigen Expressionslevel von HOXB4 in dem murinen in vivo - Modell. Die zweite Strategie beruht auf einem induzierbaren Dimerisierungs-System. Dazu wurden zunächst lentivirale Fusionskonstrukte, bestehend aus FKBP12 und einer Signaldomäne entweder des EGF-Rezeptors oder des Prolaktin-Rezeptors, kloniert. FKBP12, eine modifizierte Form des für das Immunsystem wichtigen FK506-binding Proteins, fungiert hier als induzierbare, durch Zugabe des kleinen Dimerisierungsmoleküls AP20187, anschaltbare Dimerisierungsdomäne. Dimerisierung von zwei Fusionprotein-Monomeren sollte die jeweilige Signaltransduktionskaskade anschalten. Die chemische Substanz AP20187 kann sowohl in Zellkultur als auch in in vivo Mausmodell-Experimenten ohne toxische Nebenwirkungen verwendet werden. Durch dieses System sollte die selektionierende Wirkung der Signaldomäne kontrollierbar an- und abschaltbar gemacht werden. Die Aktivität des Fusionsproteins ist also durch Zugabe und Wegnahme des chemischen Moleküls AP20187 steuerbar. Lentivirale Vektoren, die das EGFR-Konstrukt exprimierten, induzierten in BaF/3 Zellen deutlich gesteigertes Zellwachstum und führten zu einer kompletten Selektion gen-modifizierter Zellen innerhalb von 18 Tagen von 20% transduzierter auf 99% gp91phox tragender Zellen. Diese induzierte Proliferation ließ sich jedoch nach Wegnahme des Moleküls AP20187 nicht abschalten. Auch nach 2 Wochen AP20187 Entzug teilen sich die Zellen mit fast ungeminderter Schnelligkeit weiter. Aufgrund dieser unkontrollierbaren und möglicherweise onkogenen Eigenschaften schien uns dieses Selektionsmodell als nicht anwendbar. Das weitere Konstrukt, welches anstelle der EGF-Rezeptor-Signaldomäne die komplette intrazelluläre Phosphotyrosinkinase-Domäne des Prolaktin-Rezeptors enthält, verursachte nach AP20187 Stimulation ebenfalls eine deutliche Proliferationssteigerung und eine Selektion von 19% zu 96% gp91phox positiver BaF/3 Zellen. Dieser Proliferationsvorteil konnte durch Entnahme des AP20187 wieder ausgeschaltet werden. Bereits 2 Tage nach Entzug der AP20187 Stimulation nimmt die Zellzahl deutlich ab. Nach diesem Test in BaF/3 Zellen wurde ein neuer bicistronischer retroviraler Vektor kloniert, bestehend aus dem therapeutische Gen gp91phox und dem selektionsvermittelndem Prolaktinrezeptor-Fusionskonstrukt (PrlR-Konstrukt). Nach Überexpression des Konstruktes in transduzierten murinen SC1 Zellen haben konfokale Lasermikroskopiestudien gezeigt, dass dieses PrlR-Fusionsprotein, welches keine membranverankernden Sequenzen des Prolaktinrezeptors mehr besitzt, hauptsächlich im Zytoplasma der Zelle lokalisiert ist. Von den wesentlichen Prolaktin-aktivierten Signalwegen, dem Jak/Stat-Signalweg, dem Ras/Raf/MAP-Kinase-Signalweg und dem Fyn/Sos/Vav-Signalweg, wurde der Jak/Stat-Signalweg untersucht, da er eine zentrale Rolle in der Hämatopoese spielt. Möglicherweise verursacht das aktivierte PrlR-Konstrukt gesteigerte Proliferation und Stammzellselektion durch Aktivierung des STAT5-Signalweges. Es wurde bereits in STAT5 Knockout Maus-Modellen gezeigt, dass STAT5 eine wichtige Rolle für den Erhalt der hämatopoetische Stammzellen spielt. Die vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass nach Expression des PrlR-Konstruktes und Stimulation mit AP20187 ein gesteigerter STAT5-Phosphorylierungsstatus und eine vermehrte Bindung von STAT5 an Promotorsequenzen des STAT5 Zielgens ß-Casein in BaF/3 Zellen resultieren. AP20187 induzierte Aktivität des PrlR-Konstruktes vermag auch gänzlich ohne IL-3 Stimulation STAT5 in vergleichbarer Stärke zu phophorylieren. In Kontroll-Vektor transduzierten Zellen waren hingegen kein Signal detektierbar. In dieser Zelllinie vermag die Expression des PrlR-Konstruktes nach zwei Wochen AP20187 Stimulation die Proliferation um den Faktor 1.500 bis 27.000 zu steigern. Simultan wurde in FACS- Analysen eine Zunahme der gp91phox Expression von 3% auf 70% beobachtet. Dieser proliferationssteigernde Effekt ist, wie auch zuvor für das lentivirale Konstrukt beobachtet, nach Wegnahme des AP20187 reversibel, was eine wichtige Eigenschaft im Hinblick auf weitere Anwendungen, möglicherweise in humanen Studien, darstellt. Auf Proteinebene kann in den transduzierten BaF/3 Zellen nach Selektion mit AP20187 ein deutlich stärkeres Signal für das PrlR-Konstruktes nachgewiesen werden. Auch gen-modifizierte murine Stammzellen können unter AP20187 Stimulation ex vivo um den Faktor 20 bis 100 expandiert werden, ohne ihre Stammzelleigenschaften und die Fähigkeit zu allen Blutzellen der verschiedenen Reihen beizutragen, zu verlieren. In der FACS-Analyse wurde deutlich beobachtet, dass PrlR-Konstrukt modifizierte Stammzellen unter AP20187 Stimulation wichtige Stammzell-Oberflächenmarker wie Sca1 und c-kit über einen Zeitraum von 2 Wochen in hohen Levels exprimieren. Während in der Abwesenheit von AP20187 die Stammzellen in die Differenzierung eintreten, behalten AP20187 stimulierte Zellen den Stammzellphänotyp bei. Hier nimmt die Zahl der Sca1- und c-kit-positiven Zellen von 20% auf 70% und von 12% auf 40% zu. In Methylcellulose basierten Assays (CFU-Assays) können diese Stammzellen, ähnlich wie im Knochenmark, Kolonien von Vorläuferzellen aller Blutzellreihen bilden. Die selektionierten murinen Zellen wurden auf die Fähigkeit, Kolonien zu bilden, hin untersucht. Nach 14-tägiger Inkubation bildeten AP20187 stimulierte PrlR-Konstrukt gen-modifizierte primäre Mause-Knochenmarkzellen deutlich mehr Kolonien aus. Während Kontrollzellen ohne AP20187 Stimulation lediglich 15 Kolonien pro 1.000 ausplattierten Zellen bilden, liegt die Zahl unter AP20187 Stimulation bei 75 Kolonien. In weiterführenden FACS-Analysen dieser Zellen wird ersichtlich, dass PrlR-Konstrukt transduzierte Zellen unter AP20187 Stimulation dennoch zu einem kleinen Ausmaß in die verschiedenen Blutzell-Richtungen differenzieren können. Sie sind zu einem geringen Teil positiv für die Oberflächenmarker Gr-1 (myeloische Zellreihe) mit 2,7%, B220 (B-Zellen) mit 24% und CD3 (T-Zellen) mit 1,2%. Allerdings ist die Oberflächenmarker-Expression deutlich schwächer als in PrlR-Konstrukt-transduzierten Zellen unter alleiniger Zytokin-Stimulation ohne AP20187. Der prozentuale Anteil der Gr-1, B220 und CD3 positiven Zellen beträgt hier 30%, 70% und 17,8%. Vermutlich veranlassen die Expression des PrlR-Konstruktes und die gleichzeitige Aktivierung durch AP20187 die Stammzelle zur ständigen Selbsterneuerung. Simultan wird dabei die Differenzierung hin zu den verschiedenen Vorläuferzellen unterdrückt. Dies würde erklären, warum es zu einer Anreicherung der Stammzellpopulation kommt. Um ferner eine mögliche onkogene Eigenschaft der PrlR-Konstrukt-Aktivierung auszuschließen, wurden die zweiwöchig selektionierten Mause-Knochenmark-Zellen auf ihre Klonalität mit der Ligation-vermittelnde PCR (LM-PCR)-Methode hin untersucht. Es kann klar gezeigt werden, dass es innerhalb der selektionierten Zellen zahlreiche hervorgegangene Klone gibt und die retrovirale Vektorsequenz auf unterschiedlichen Chromosomen in verschiedenen Gen-Abschnitten integriert wurde. Diese polyklonale Situation spricht gegen eine mögliche onkogene Potenz des PrlR-Fusionsproteins. In anschließend durchgeführten Maus-Transplantationsexperimenten können ex vivo expandierte Knochenmarkzellen das Knochenmark von tödlich bestrahlten Mäusen wieder herstellen. Während die Kontroll-Mäuse, die mit unselektionierte Zellen transplantiert wurden, 12-14 Tage nach der Transplantation gestorben sind, haben Mäuse, die mit AP20187 stimulierten Zellen transplantiert wurden, bis zum Abschluss der Versuche (8-10 Wochen nach Transplantation) überlebt. Dieses Ergebnis zeigt, dass es eine ausreichende Anzahl an frühen Stammzellen in der AP20187 stimulierten Zellenpopulation gab, um das Blutsystem der tödlich bestrahlten, myeloablatierten Empfängermäuse wiederherzustellen. Das Engraftment der Spenderzellen lag, gemessen in peripheren Blutzellen bei 5% bis 80%, bei 1% bis 50% in Knochenmarkzellen und bei 5,5% bis 80% in Milz-Zellen. Allerdings war die transgene Experessionsrate, gemessen als gp91phox Expression in der FACS-Analyse, im Bereich von 5%, in allen Mäusen sehr niedrig, sogar in Mäusen mit hohem Entgraftment. Möglicherweise stellt ein großer Anteil der ex vivo selektionierten Zellen zwar Sca1 positive Vorläuferzellen, aber keine frühen, pluripotenten Stammzellen, dar und geht durch Differenzierung verloren. Die Tatsachen, dass diese Mäuse überlebt haben und Gen-modifizierte Zellen in Knochenmark, Milz wie auch peripherem Blut gefunden wurden, legt nahe, dass die ex vivo Selektion auch auf früher Stammzellebene stattgefunden haben muss. In genomischer DNA aus Zellen von Knochenmark, Milz und peripheren Blut der transplantierten Mäuse konnten mittels PCR Sequenzen von gp91phox nachgewiesen werden. Somit tragen die gen-modifizierten murinen Stammzellen zur Rekonstitution der Hämatopoese bei. Weiterhin wurden von 5 Mäusen, transplantiert mit PrlR-Konstrukt transduzierten und ex vivo AP20187 selektioneierten Stammzellen, 10 Wochen nach Transplantation Knochenmarkzellen entnommen und wieder ex vivo unter AP20187 Stimulation kultiviert. Knochenmarkzellen von 3 der 5 Mäuse konnten ex vivo wieder unter AP20187 Stimulation deutlich vermehrt und selektioniert werden. Der prozentuale Anteil der gp91phox exprimierenden Zellen stieg von anfangs weniger 5% auf über 70%. In Gegensatz dazu haben die nur mit Zytokinen kultivierten Knochenmarkzellen nach zwei Wochen Kultivierung lediglich einen Anteil von 10% gp91phox exprimierender Zellen. Diese ex vivo unter AP20187 wieder re-stimulierten versus unstimulierten Knochenmark-Zellen wurden ebenfalls in Methylzellulose-Assays auf Koloniebildung hin untersucht. AP20187 stimulierte Zellen von 2 Mäusen zeigten signifikant höhere Kolonie-Anzahlen als die der unselektionierten Zellen. Die PCR-Analysen mit Primer-Paaren sowohl für das gp91phox Transgen als auch für das PrlR-Selektionsmolekühl zeigten, dass 100% der Kolonien aus AP20187 stimulierten Zellen für beide Gene starke Signale aufweisen. Dagegen ist dies bei lediglich 10% der Kolonien aus unselektionierten Zellen nachgewiesen worden. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass selektive Expansion von murinen hämatopoetischen Stammzellen mit Hilfe von verschiedenen aktivierten Signalmolekülen ex vivo erreicht werden kann. Als besonders vielversprechend hat sich das in seiner Aktivität regulierbare PrlR-Konstrukt erwiesen. Zum einen kann es nach erfolgter positiver Selektion abgeschalten werden, zum anderen können die Gen-modifizierten Stammzellen zur Rekonstitution der kompletten Hämatopoese beitragen. Weitere Versuche und Verbesserungen können die Sicherheit und Effizienz dieses System steigern. Insgesamt bekräftigen die gezeigten Ergebnisse die Strategie, Gen-modifizierte Zellen zusätzlich zum therapeutischen Gen mit einem Selektionsmolekül für eine ex vivo und/oder in vivo Selektion auszustatten.

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Metadaten
Author:Linping ChenGND
URN:urn:nbn:de:hebis:30-27184
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Dieter SteinhilberORCiDGND, Winfried WelsORCiDGND
Advisor:Dieter Steinhilber
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2006/05/30
Year of first Publication:2005
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/04/20
Release Date:2006/05/30
Page Number:192
HeBIS-PPN:178427853
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
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