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Gregor Voß

• Hintergrund: In den letzten Jahren wurde die Relevanz des oxidativen Stress als maßgebliche Ursache der männlichen Infertilität zunehmend erkannt. Dabei wird der Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies im Ejakulat oft als Marker für eine oxidative Schädigung herangezogen. Diese Nachweismethode hat den großen Nachteil, dass kontaminierende Leukozyten das Meßergebnis entscheidend beeinflussen. Ziel: Es sollte festgestellt werden, ob der spezifische Nachweis von Malondialdehyd (MDA), einem Lipidperoxidationsprodukt, in der Fraktion motiler Spermatozoen bzw. im Seminalplasma als Marker für oxidativen Stress gelingt, welches Substrat besser geeignet ist und, ob der MDA-Nachweis von einer Leukozytenkontamination beeinflusst wird. Material und Methode: Untersucht wurden Ejakulate von 77 Patienten mit unerfülltem Kinderwunsch. Bei allen wurde ein Routinespermiogramm nach WHO (1999) durchgeführt. Als Kontrolle dienten die Ejakulate von 6 Probanden mit unauffälligen Spermiogrammen. Es erfolgte eine Separation der beweglichen Spermien mittels „Swim-up“ vom Samen. Die Proben wurden in Aliquots à 5 Millionen Spermien bei -80°C bis zur Messung aufbewahrt. Das restliche Ejakulat wurde von den weiteren Bestandteilen mittels Zentrifugation getrennt, das Seminalplasma schockgefroren und ebenfalls bei -80°C aufbewahrt. Der MDA-Nachweis erfolgte durch eine HPLC-Methode (Fa. Beckman Instruments CA 92634-3100 USA / System Gold 125) mit Fluoreszenzdetektion (Shimadzu / DATA Recorder DR3/ Spectrofluorophotometer RF-540), basierend auf einem isokratischen Verfahren mittels Trennung in einer „reversed Phase“ Säule. Die hierdurch entstandene Fragmentierung der Proben ermöglichte eine Messung des MDA, das zuvor mit einer Derivatisierungslösung eine fluoreszierende Verbindung eingegangen war. Eingesetzt wurden jeweils 5 Millionen Zellen. Ergebnis: MDA ließ sich in allen Proben nachweisen (Min. 0,26 – Max. 14,27 nmol MDA/10 Mill. Spermatozoen, im Seminalplasma 0,96 – 6,9 μmol/l). Die mindestens dafür erforderliche Zellzahl lag bei 2 Millionen Zellen. Die mittlere MDA-Konzentration betrug in der Kontrollgruppe 2,71± 1,25 nmol MDA/10 Mill. Spermatozoen (MW ± SD), bei den Patienten bei 2,94 ± 2,12 (n.s.). Die intrazelluläre MDA-Konzentration korrelierte negativ mit der Spermienkonzentration (r=0,1 p=0,004). Mit steigender Spermienkonzentration nahmen die MDA-Konzentrationen somit ab. Die MDA-Konzentrationen im Seminalplasma korrelierte nicht mit der Spermienzahl (r= 0,06 p=0,13). Ein deutlicher Zusammenhang bestand zwischen der Progressivmotilität und der intrazellulärem MDA-konzentration insofern, als bei Motilitätszunahme die MDA-Werte abnahmen (r=0,08 p=0,01). Demgegenüber waren die MDA-Konzentrationen umso höher, je mehr immotile Spermatozoen vorhanden waren (Motilitätskategorie d: r=0,093 p=0,005). Das MDA im Seminalplasma korrelierte nicht mit der Spermienmotilität. Es bestand kein Zusammenhang zwischen der intrazellulären MDA-Konzentration und dem Leukozytennachweis. Eine Subgruppenanalyse Patienten zeigte, dass einzelne Patienten (n= 8/77 [~ 10%] mit unauffälligen Spermiogrammen deutlich erhöhte MDA-Konzentrationen aufwiesen. Diese Gruppe würde bei einer Routineuntersuchung unerkannt bleiben. Schlussfolgerung: MDA ist reproduzierbar in der motilen Spermatozoenfraktion nachweisbar. Der Nachweis wurde durch kontaminierende Leukozyten nicht beeinflusst. Die MDA-Bestimmung im Seminalplasma war für den Nachweis des oxidativen Stress ungeeignet. Die MDA-Messung stellt einen Marker zur Erfassung einer oxidativen Belastung des Ejakulats dar, der mittels des Routine-Spermiogramms nicht erfasst wird. Bei ca. 10 % der Patienten könnte eine derartige Schädigung vorliegen und eine antioxidative Behandlung versucht werden.
• Background: Over the last few years the relevance of oxidative stress was a cause of male infertility. Up to now the generation of ROS in the ejaculate was taken as marker of oxidative stress. This method has the big disadvantage that contaminating leucocytes crucially influence the test results. Aim: The aim of this study was to find out whether the specific measurement of MDA, a lipidperoxidation-product, in the fraction of motile spermatozoa as well as seminal plasma as marker of oxidative stress is possible. Furthermore, the aim was to determine which substrate is best suited for MDA-measurement and whether leucocytes contamination affects the results. Material and Method: The ejaculates of 77 patients presenting for infertility work-up were examined. All samples were investigated according to WHO standards. Six (6) volunteers with normal spermogramresults served as the control group. The motile sperm-fractions were separated using a swim-up from semen procedure. The samples were stored at -80° C until analysis in aliquots of five million sperms. The remaining ejaculate was centrifuged to separate other elements from seminal plasma, which was stored at -80° C. The MDA concentration was determined by a HPLC method with fluorescence detection based on an isocratic procedure, using separation in a ‘reversed Phase’ column after a fluorescence fusion with a derivatising solution. Results: MDA was detected in all samples (min. 0,26- max. 14,27 nmol MDA/ 10 Mill. spermatozoa, in seminal plasma 0,96 – 6,9 μmol/l). The minimal necessary cell-count was 2 million cells. The middle MDA-concentration in the control group was 2,71 ± 1,25 nmol MDA/ 10 million spermatozoa (MW ± SD), in the Patients 2,94 ± 2,12. There was a negative correlation with the intracellular MDA-concentration and sperm concentration (r=0,1 p=0,004). With rising sperm concentration the MDA-concentration fell. The MDA-concentration in seminal plasma did not correlate with the sperm-count (r=0,06 p=0,13). There was a significant correlation between the motility in intracellular MDA-concentration as well as the increase in motility and the fall of the MDA values (r=0,08 p=0,01). Accordingly the higher the MDA-concentration were the presents sperms more inactive (motility-category d: r=0,093 p=0,005). The MDA in seminal plasma did not correlate with the sperm motility. There was no correlation between the intracellular concentration and presents of leukocytes. A subgroup-analysis of patients showed that single patients (n=8/ 77 [~ 10%] with a normal semen analysis had a significant raised MDA-concentration. This group would remain undetected in a routine examination. Conclusion: MDA is reproducibly measurable in the motile sperm fraction. Contaminating leucocytes did not influence its concentration. MDA in seminal plasma was not suited. The MDA measurements allowed to detect an oxidative exposure, which could not be detected by routine spermatogram analysis. Such damage was found in approximately 10% of the patients.