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Vijayalaxmi Manoharan

• Despite the well-known importance of ribonucleic acids (RNA) in cell biology, it is astounding to realize the pace at which new fundamental functions of RNAs have been discovered. One of the fundamental reasons for the multitude of functions of RNA is the property of RNA to adopt different conformations or folds. The primary sequence of RNA, a linear polymer built from four different repetition units, can fold into alternate secondary structure motifs which in turn form alternate long-range interactions in complex tertiary structures. Ligands such as metal ions or small molecular weight metabolites and also proteins or peptides can bind to RNA and induce the changes in tertiary conformation. For example, in the cell, RNA participates in gene regulation in the form of riboswitches. Riboswitches are found in untranslated regions of messenger RNA (mRNA) and adopt alternate conformations depending on the presence or absence of specific metabolites. If a metabolite is present above a specific concentration, it induces a conformational change in the respective riboswitch by binding and thereby alters gene expression. Another example is the RNA thermometer which participates in the cell translational mechanism by a similar strategy. Translation initiation requires the binding of RNA thermometers to the ribosome. The ribosome binding region is located in the 5’ untranslated region of mRNA. At low temperatures this region is prevented from binding to the ribosome by forming basepairs. At higher temperatures, these basepairs dissociate allowing ribosome binding and subsequent translation. Therefore, the characterization and delineation of the kinetics and pathway of RNA folding is important to understand the function of RNA and is an important contribution to fundamentally understand RNA’s role in the cell. RNA conformational transitions occur over a wide range of timescales. Depending on the timescale, various biophysical techniques are used to study RNA conformational transitions. In these biophysical studies, achieving good structural and temporal resolution constitute frequently encountered challenges or limitations. For example, single molecule FRET spectroscopy provides high temporal resolution in the milliseconds at high sensitivity but lacks atomic resolution. Recent advances in the field of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy have enabled the elucidation of tertiary folding events to be characterized with atomic resolution. This thesis involves the use of NMR spectroscopy to characterize the folding of RNA molecules. Kinetics experiments require rapid initiation of the kinetics followed by monitoring of the reaction. In this thesis, two different folding initiation techniques have been applied and coupled to the subsequent detection of RNA folding using NMR spectroscopy, namely, photocaging and rapid mixing. The method of photocaging is well established (Kuhn and Schwalbe, 2000) and builds on the following principle: A photolabile moiety is attached to a molecule that prevents a specific interaction. Upon irradiation of the molecule with the photolabile group using laser light at a specific wave length, at which the molecule of interest is not absorbing, the protecting group is released. In our group, together with the group of S. Pitsch, ETH Lausanne, we could "cage" RNA at its equilibrium state by a photolabile molecule (similar work has been carried out in the group of A. Heckel). Rapid and traceless release of the photolabile precursor compound by a laser pulse releases the RNA to fold into its native state; the build-up of the native state of the RNA is monitored by NMR signals that are uniquely characteristic for the native state of the RNA. By optically coupling a laser source to an NMR magnet, the above procedure can take place in situ and the kinetics recorded by NMR. Several different molecules can be caged: The photocage can be attached to RNA. Then, a modified photolabile nucleotide can be placed at strategic positions of a target RNA whose folding properties is to be studied. The photocage can also be attached to a ligand: if folding is dependent on ligand binding then the ligand can be modified to carry a photosensitive unit whose degradation allows binding to RNA. In this thesis, an alternative method for photocaging is introduced. Here, metal ions essential for folding of the RNA are photocaged using the photolabile chelating agent Dimethyl-nitrophen (DMN). Photolysis of DMNr releases the metal ion, thereby RNA folding is initiated. In the rapid-mixing technique, one of (several) components required for proper folding of the RNA is rapidly injected into an NMR sample in situ by the use of a pneumatic injection device. ...
• Trotz der bekannten Bedeutung der Ribonukleinsäuren (RNA) in der Zellbiologie ist es erstaunlich, dass neue grundlegende Funktionen von RNAs erst vor kurzem entdeckt wurden. Einer der Hauptgründe für die vielen Funktionen der RNA ist ihre Eigenschaft, verschiedene Konformationen, auch Faltungen genannt, anzunehmen. Die Sequenz der RNA, ein lineares Polymer aus vier verschiedenen wiederholten Einheiten, kann sich falten in alternative Sekundär-Struktur-Motive, die unter Ausbildung weitreichender Wechselwirkungen komplexe tertiäre Strukturen einnehmen. Liganden wie Metallionen oder Metaboliten mit niederem Molekulargewicht, aber auch Proteine oder Peptide können an RNA binden und dadurch Veränderungen der tertiären Konformation induzieren. In prokaryotischen Zellen partizipiert RNA an der Regulation der Genexpression in Form von Riboswitches. Riboswitches sind Bestandteile der nicht-translatierten Regionen der Boten-RNA (mRNA) und nehmen unterschiedliche Konformationen an, je nach Vorhandensein oder Fehlen von spezifischen Metaboliten. Wenn ein Metabolit oberhalb einer bestimmten Konzentration vorliegt, induziert die Bindung dieses Metaboliten eine Konformationsänderung im jeweiligen Riboswitch. Damit ändert sich die Genexpression. RNA-Thermometer partizipieren in der Zelle am translationalen Mechanismus durch eine ähnliche Strategie. Die Ribosomenbindungsregion (Shine-Darlargno, SD-Sequenz) befindet sich in der 5'-nicht-translatierten Region und ist verantwortlich für den Start der Translation; im ersten Schritt bindet eine Untereinheit des Ribosoms an diese Region. Bei niedrigen Temperaturen wird die Bindung des Ribosoms an die SD-Sequenz durch die Bildung von Basenpaaren in der SD-Sequenz verhindert. Daher ist die Charakterisierung der Kinetik und der Faltungswege der RNA wichtig zum Verstehen der Funktion der RNA und ein wichtiger Beitrag zum Verständnis der grundlegenden Funktionen der RNA in der Zelle. RNA-Konformationsänderungen treten über einen großen Bereich von Zeitskalen auf. Je nach der Zeitskala können verschiedene biophysikalischen Techniken verwendet werden, um Konformationsänderungen der RNA zu untersuchen. In biophysikalischen Studien stellt das Erreichen einer hohen strukturellen und zeitlichen Auflösung häufig Probleme dar. Zum Beispiel liefert Einzel-Molekül FRET-Spektroskopie hohe zeitliche Auflösung im Millisekundenbereich bei hoher Empfindlichkeit, aber nicht atomare Auflösung. Jüngste Fortschritte im Bereich der Kernresonanzspektroskopie (engl. nuclear magnetic resonance, NMR) ermöglichen es, tertiäre Faltung von RNA mit atomarer Auflösung aufzulösen. Diese Dissertation widmet sich der NMR-spektroskopischen Untersuchung der Faltung von RNA-Molekülen. Kinetische Experimente erfordern die rasche Induktion der Kinetik, gefolgt vom der Detektion des Reaktionsverlaufs. In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Techniken zur Faltungeinleitung angewendet, nämlich Photocaging und rasche Vermischung. Die Methode des Photocaging ist gut etabliert und baut auf dem folgenden Prinzip auf: Eine photolabile Schutzgruppe wird in einem Molekül so eingeführt, dass eine spezifische Interaktion verhindert wird. Nach Bestrahlung des Moleküls mit Laser-Licht einer bestimmten Wellenlänge wird die Photoschutzgruppe abgespalten. Zusammen mit der Gruppe von Prof. S. Pitsch, ETH Lausanne, konnten wir photolabile RNA-Nukleotidderivate entwickeln und mittels zeitaufgelöster NMR-Spektroskopie untersuchen (ähnliche RNAs wurden in der Gruppe von Prof. A. Heckel entwickelt). Schnelle und möglichst spurenlose Freisetzung der photolabilen Vorläufer-Verbindung mit einem Laserpuls induziert die Faltung der RNA und die Bildung des nativen Zustand der RNA wird durch NMR-Signale beobachtet, die charakteristisch für den nativen Zustand der RNA sind. Durch optische Kopplung eines Lasers an einen NMR-Magneten kann das oben beschriebene Verfahren in-situ erfolgen und die Kinetik durch NMR aufgezeichnet werden. Mehrere verschiedene Moleküle können mit einer photolabilen Schutzgruppe versehen werden: Die Photoschutzgruppe kann direkt an RNA kovalent gebunden werden. Solche photolabil modifizierten Nukleotide können an strategischen Positionen der Ziel-RNA eingeführt werden, deren Faltungseigenschaften untersucht werden sollen. Die Photoschutzgruppe kann auch an einem Liganden angebracht werden: Wenn die RNA-Faltung von Ligandbindung abhängig ist, kann diese Bindung durch die Photoschutzgruppe unterbunden werden. In dieser Arbeit wird eine alternative Methode für das so genannte "Photocaging" eingeführt. Metallionen, die für manche RNA einen wesentlichen Kofaktor für die Faltung darstellen, werden in der Form des photolabilen Metall-DM-Nitrophen (DMN)-Komplexes chelatisiert. Photolyse des DMN setzt diese Metallionen frei, wodurch RNA-Faltung initiiert wird. In der Mischtechnik wird eine der Komponenten, die für die Faltung der RNA notwendig ist, schnell in ein NMR-Proberöhrchen durch Einsatz eines pneumatischen Injektions-Gerätes in situ injiziert. ...