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Rapamycin induces TGFβ [TGF-beta], Smad-mediated profibrotic gene expression in renal mesangial cells upstream and independent of mTOR

  • The mTOR kinase inhibitor rapamycin (sirolimus) is a drug with potent immunosuppressive and antiproliferative properties. We found that rapamycin induces the TGF/Smad signaling cascade in rat mesangial cells (MC) as depicted by the nuclear translocation of phospho-Smads 2, -3 and Smad-4, respectively. Concomitantly rapamycin increases the nuclear DNA binding of receptor (R)- and co-Smad proteins to a cognate Smad-binding element (SBE) which in turn causes an increase in profibrotic gene expression as exemplified by the connective tissue growth factor (CTGF) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1). Using small interfering (si)RNA we demonstrate that Smad 2/3 activation by rapamycin depends on its endogenous receptor FK-binding protein 12 (FKBP12). Mechanistically, Smad induction by rapamycin is initiated by an increase in active TGF1 as shown by ELISA and by the inhibitory effects of a neutralizing TGF antibody. Using an activin receptor-like kinase (ALK)-5 inhibitor and by siRNA against the TGF type II receptor TGF-RII) we furthermore demonstrate a functional involvement of both types of TGF receptors. However, rapamycin did not compete with TGFfor TGF-receptor binding as found in radioligand-binding assay. Besides SB203580, a specific inhibitor of the p38 MAPK, the reactive oxygen species (ROS) scavenger N-acetyl-cysteine (NAC) and a cell-permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic strongly abrogated the stimulatory effects of rapamycin on Smad 2 and 3 phosphorylation. Furthermore, the rapid increase in Dichlorofluorescein (DCF) formation implies that rapamycin mainly acts through ROS. In conclusion, activation of the profibrotic TGFSmad signaling cascade accompanies the immunosuppressive and antiproliferative actions of rapamycin. Keywords: FK506 binding protein; p38 MAP kinase; rapamycin; renal fibrosis; Smads; TGFβ
  • Die Calcineurininhibitoren (CNIs) Cyclosporin A und Tacrolimus sind seit ihrer Einführung in den frühen 1980 er Jahren nach wie vor Meilensteine der immunsuppressiven Therapie als auch in der Transplantationsmedizin. Trotz ihrer unverzichtbaren Rolle, zählen progressive und chronische Nierenschädigungen zu den gefürchteten Nebenwirkungen von CNIs insbesondere bei der längeren Therapien. Die durch CNIs hervorgerufene Nephrotoxizität ist histologisch durch das Auftreten von Glomerulosklerosen und tubulointerstitielle Fibrosen charakterisiert. Hierbei spielt der Transforming growth factor 1 (TGF1) als fibrogenes Zytokin eine herausragende Rolle. Der mTOR-Kinase Inhibitor Rapamycin (Sirolimus) ist ein Makrolidantibiotikum mit potenten immunsuppressiven und zugleich antiproliferativen Eigenschaften. Obwohl Rapamycin selbst nur wenig bzw. keine nephrotoxischen Eigenschaften besitzt, haben einige Arbeiten der letzten Jahre darüber berichtet, dass Rapamycin unter bestimmten Umständen renale Funktionen verschlechtern kann und die CsA-Nephrotoxizität unter bestimmten Umständen zusätzlich erhöht. Daher hat sich die vorliegende Arbeit mit der wichtigen Fragestellung beschäftigt, ob Rapamycin, vergleichbar mit den CNIs, ebenfalls in der Lage ist, profibrotische TGF/Smadvermittelte Signalkaskaden in Mesangiumzellen zu aktivieren. Mit Hilfe verschiedener experimenteller Ansätze konnte gezeigt werden, dass Rapamycin die TGF/Smad-vermittelte Signalkette in Mesangiumzellen der Ratte induzieren kann, was durch eine nukleäre Translokation der phosphorylierten Smad 2 und Smad 3 Proteine sowie des Smad 4 Proteins und durch deren nachfolgende DNA-Bindung an Smad-spezifische Promotorelemente manifestiert wird. Die nachfolgende Aktivierung fibrogener Genexpressionen wurde anhand der Rapamycininduzierten Promotoraktivitäten von “Connective tissue growth factor” (CTGF) und Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) gezeigt und diese konnte anhand von erhöhten Proteinspiegel der beiden Faktoren tatsächlich bestätigt werden. Über transiente Transfektion von spezifischen siRNAs konnte schliesslich gezeigt werden, dass die Rapamycin-vermittelte Aktivierung der Smad Signalkaskade unabhängig von mTOR ist, während das FKBindeprotein 12 (FKBP12) für die Aktivierung der Smad Signalkaskade unerlässlich scheint. Auf der Suche nach den molekularen Ursachen der Rapamycin-induzierten Smad Aktivierung, konnte mit Hilfe eines TGF-spezifischen ELISAs gezeigt werden, dass Rapamycin die schnelle Aktivierung von latentem TGF bewirkt. Die Bedeutung von freiem TGF konnte weiterhin durch die inhibitorische Wirkung eines TGF-neutralisierenden Antikörpers belegt werden. Mit Hilfe eines für die Activin-receptor-like kinase (ALK)-5 spezifischen Inhibitors sowie durch siRNA Attenuation des TGF-Typ II Rezeptors I konnte letzendlich auch die funktionelle Bedeutung beider TGF-Rezeptoren bei der Rapamycinvermittelten Smad Aktivierung bestätigt werden. Hingegen scheint Rapamycin nicht über eine Kompetition mit freiem TGF zu wirken wie aus den Ergebnissen von Radioligandenbindungsstudien ersichtlich wurde. Neben SB203580, einem spezifischen Hemmstoff der p38 MAP Kinase, konnte die stimulierende Wirkung des Rapamycin auf die Phosphorylierung der Rezeptor (R)-Smads zusätzlich durch das Antioxidans NAcetylcystein, sowie durch die Zugabe eines membrangängigen Superoxiddismutate (SOD) Mimetikums aufgehoben werden. Gleichzeitig, zeigt der schnelle Anstieg von Dichlorfluorescein (DCF), dass Rapamycin über eine Hemmung der endogenen SOD eine verstärkte Sauerstoffradikalbildung hervorruft, welche letztendlich zu einerAktivierung des latent gebundenen TGF führt. Zussammenfassend machen die Ergebnisse dieser Arbeit deutlich, dass Rapamycin neben seinen etablierten immunsuppressiven und antiproliferativen Eigenschaften über eine Aktivierung der profibrogenen TGF/Smad Signalkaskade zusätzlich auch profibrotische Eigenschaften besitzt.

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Metadaten
Author:Bashier Ibrahim Osman
URN:urn:nbn:de:hebis:30-90172
Referee:Josef PfeilschifterGND, Manfred Schubert-ZsilaveczGND
Advisor:Wolfgang Eberhardt
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Year of Completion:2009
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2010/05/03
Release Date:2011/02/15
Tag:FK506 binding protein; Smads; TGFβ; p38 MAP kinase; rapamycin; renal fibrosis
Page Number:139
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:425068161
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Pharmazie
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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