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Juliane Werner

• Viele aerobe Organismen besitzen eine NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, ein Enzym, welches der Haupteintrittspunkt für Elektronen in die Atmungskette darstellt. An den Elektronentransfer ist die Protonentranslokation vom Zytosol in den Intermembranenraum der Mitochondrien gekoppelt. Störungen des mitochondrialen Energiestoffwechsels bedingen Mitochondriopathien. Der Befall verschiedener Organsysteme, v.a. denjenigen mit hohem Energiestoffwechsel (Gehirn, Skelettmuskel, Retina, Myokard), verursacht multiple Symptome, was für diese Erkrankungen bezeichnend ist. Die Aufklärung der exakten Funktionsweise eines Enzyms bedarf der Kenntnis über seine räumliche Struktur. Diese lässt sich zur Zeit für ein Protein dieser Größe nur mittels Elektronenmikroskopie an zweidimensionalen Kristallen oder durch Röntgenkristallographie an dreidimensionalen Einkristallen realisieren. Das Ziel und die Herausforderung dieser Arbeit galt der Kristallisation und Strukturanalyse der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, eines der größten Membran-proteinkomplexe. Mit Hilfe der Kristallisation sollten Auskünfte über die Struktur und Rückschlüsse auf seine Funktion, sowie weitere Einblicke in die Bedeutung dieses Proteinkomplexes ermöglicht werden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen eine L-förmige Struktur des Enzyms mit einem peripheren Arm, der in die mitochondriale Matrix ragt, und einem Membranarm, der in der Lipiddoppelschicht angeordnet ist. In beiden Armen befinden sich insgesamt bis zu 46 Untereinheiten des Enzymkomplexes. Die NADH-Bindungsstelle und alle bekannten Redoxgruppen (FMN, bis zu neun FeS-Zentren) liegen im peripheren Arm. Der Winkel zwischen beiden Armen ist variabel. Mit dem Ziel Komplex I in seiner Gesamtheit zu kristallisieren, wurden Antikörperfragmente zur Ko-Kristallisation eingesetzt. Die Βedeutung der Fv-Fragmente, als kleinste antigenbindende Domäne eines Antikörpers, liegt in der Vergrößerung der hydrophilen Oberfläche. Es wurden Fv-Fragmente gegen die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus Yarrowia lipolytica erzeugt und ihre Eignung für die Kristallisation überprüft. Die Klonierung und Expression erfolgte in Escherichia coli. Es zeigte sich durchweg nur ein sehr niedriges oder auch vollkommen unbefriedigendes Expressionsniveau der Fv-Fragmente. Nach gezielter Mutation konnte bei dem Klon Y30C12 eine Expressionssteigerung erreicht werden, welche allerdings für Kristallisationsversuche noch immer unzureichend war. Mit dem Klon Y34C10 konnte in Expressionsversuchen eine ausreichende Menge an Fv-Fragmenten gewonnen werden. Mit diesen Fv-Fragmenten gelang auch die Einschrittreinigung an der Streptavidin-Sepharosesäule und es konnten Bindungs- und Kristallisationsversuche mit Komplex I unternommen wurden. Durch eine FPLC-Gelfiltration konnte ein stöchiometrischer 1:1 Komplex aus der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase und dem Fv-Fragment Y34C10 gewonnen werden, welcher bei der Suche nach geeigneten Kristallisationsbedingungen eingesetzt wurde. Eine Kristallisation des Komplexes gelang unter den ausgewählten Bedingungen mit diesem Komplex jedoch noch nicht. Dennoch eignen sich die Klone Y34C10 und Y30C12-M für weitere Studien, die eine Expressionssteigerung durch Punktmutationen in der schweren und leichten Kette (siehe unter 4.3) beinhalten sollten. Zum anderen besteht die Wahrscheinlichkeit den Kristallisationserfolg durch breite Variation der Bedingungen zu erhöhen. ...
• Many aerobe organisms contain NADH:ubiquinone oxidoreductase, the entry point for the major fraction of electrons that traverse the respiratory chain resulting eventually in the reduction of oxygen. (Coupled to the electron transfer, protons are pumped from the matrix side to the intermembrane space of mitochondria.) Disturbances of the mitochondrial energy-metabolism cause mitochondriopathies. Typical for these illnesses are dysfunction of organ systems with high energy-metabolism (brain, skeleton-muscle, retina, myocard). Elucidating the catalytic mechanism of an enzyme requires knowledge of its three dimensional structure. Presently, this can be realized for a protein of this size only by means of electron microscopy on two-dimensional crystals or by X-ray crystallography on three-dimensional crystals. The generation of an electro-chemical potential gradient depends on transmembrane proton translocation, with the catalytic mechanism of action still being partly unknown; a deeper understanding of its function may be achieved by gaining additional information on the structure of this membrane protein. The challenging objective pursued in this study focuses on the crystallization and structural analysis of the NADH:ubiquinone oxidoreductase, one of the largest catalytic complexes known. The crystallization of this membrane protein, which is an essential component of the respiratory chain, may reveal additional information on its molecular structure and should also allow conclusive observations on its function and impact. Electron microscopic images show an L-shaped structure of the enzyme with a peripheral arm, which protrudes into the mitochondrial matrix, and a membrane arm located in the lipid bilayer. Both parts together are composed of up to 46 subunits. The NADH binding site and all well-known redox groups (FMN, up to nine FeS centers) reside in the peripheral arm. The angle between both arms is variable. Fv fragments, being the smallest antigen-binding unit of an antibody were used to promote crystallization the whole complex I. The main feature of these Fv fragments is in the enlargement of the hydrophilic surface, to increase crystallization probability. Fv fragments recognizing the NADH:ubiquinone oxidoreductase, isolated from Yarrowia lipolytica, were examined for their suitability for crystallization. Cloning and expression was done in Escherichia coli. Upon characterization of the recombinant Fv clones, only a very low or an unsatisfactory expression level of Fv fragments was observed within all clones. After site directed mutagenesis of specific residues a larger quantity of Fv fragments could be expressed with clone Y30C12. However, the yield was still insufficient for the following crystallization assays. By using clone Y34C10, we obtained a sufficient amount of Fv fragments in expression experiments. This Fv fragment could be successfully isolated in a one step purification on streptavidin sepharose. Following this, binding and crystallization assays with complex I were carried out. Using a FPLC gel filtration, a stoichiometric 1:1 complex of NADH:ubiquinone oxidoreductase and the Fv fragment Y34C10 was prepared, which was then used to look for suitable crystallization conditions. However, crystallization of the complex was not yet successful under the selected conditions. Nevertheless, the clones Y34C10 and Y30C12-M are suitable for further studies that should comprise an increase of the expression level through point-mutations in the heavy and light chain (see under 4.3). Moreover, the likelihood to obtain crystals should increase by variation of the conditions or through a new screen.