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Thorsten Althoff

• Die Atmungskette in der inneren Membran der Mitochondrien besteht aus fünf großen Enzymkomplexen. Die NADH-Dehydrogenase (I), Succinat-Dehydrogenase (II, indirekt), Cytochrom c-Reduktase (III) und Cytochrom c-Oxidase (IV) nutzen die Energie aus Elektronentransfers zum Aufbau eines Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran. Dieser wird anschließend von der FOF1-ATP-Synthase (V) als Energiequelle zur Phospho-rylierung von ADP verwendet. Für lange Zeit bestand eine Kontroverse, wie diese Proteine in der Membran organisiert sind. Nach dem „random collision“-Modell diffundieren sie frei als Einzelmoleküle und treffen sich nur zufällig, während sie nach dem „solid state“-Modell größere funktionelle Einheiten bilden. In den letzten Jahren gab es vermehrt Hinweise darauf, dass das letztere Modell das zutreffendere ist, da tatsächlich sogenannte Superkomplexe der Atmungskette in aktiver Form isoliert werden konnten. Schließlich konnte 2007 die erste drei-dimensionale Rekonstruktion eines Superkomplexes, bestehend aus Komplex I, dimerem Komplex III und Komplex IV publiziert werden. Aufgrund der Einschränkungen der verwendeten Negativkontrasttechnik hatte dieses Modell allerdings nur eine niedrige Auflösung und repräsentierte durch die Dehydrierung keinen nativen Zustand. Dadurch ließen sich die Strukturen der einzelnen Komplexe nur ungenau einpassen. Um diese Probleme zu umgehen, sollte eine Struktur unter Kryo-Bedingungen rekonstruiert werden. Um die für Kryo-EM benötigte größere Ausbeute und höhere Konzentration zu erzielen, wurde ein neues Reinigungsprotokoll für die Superkomplexe etabliert. Die wesentlichen Punkte darin sind der Austausch des für die Solubilisierung verwendeten Digitonins durch Amphipol A8-35 mittels ?-Cyclodextrin und eine anschließende Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Im BN-PAGE zeigten die auf diese Art gereinigten Superkomplexe das gleiche Banden- und Aktivitätsmuster wie Proben in Digitonin. Auch bei einer Einzelpartikelanalyse nach Negativ-kontrastfärbung konnten keine Unterschiede festgestellt werden und die Partikel zeigten ähnliche Orientierungen wie in der vorherigen Studie. Einige neue Ansichten ließen sich jedoch nicht zuordnen und stellten eventuell eine Verunreinigung mit größeren Superkomplexen dar. Da auch bei der Reinigung mit Amphipol die Proteinkonzentration letztlich nicht wesentlich erhöht werden konnte und sich die Superkomplexe nicht wie für Kryo-EM erforderlich in einen löchrigen Kohlefilm einlagerten, wurden die Proteine auf einem durchgehenden Kohlefilm in einer dünnen Pufferschicht vitrifiziert. Die dabei zu beobachtenden bevorzugten Orientierungen, sollten auch die Unterscheidung von verschiedenen Populationen von Superkomplexen erleichtern. Eine erste 3D-Rekonstruktion wurde mit Hilfe der „random conical tilt“-Methode errechnet. Dieses Modell wurde durch „projection matching“ bis zu einer Auflösung von 19 Å verfeinert, womit die Auflösung fast doppelt so hoch ist, wie bei der Rekonstruktion aus Negativ-kontrastfärbung (36 Å). Die Struktur repräsentiert einen natürlichen Zustand des Proteins und zeigt Details wie einzelne Domänen, Spalten zwischen Domänen und eine starke Krümmung des Membranarms von Komplex I, die zuvor nicht erkenn-bar waren. Die Amphipole bilden einen Gürtel um den Transmembranbereich. Die Röntgenstrukturen von Komplex I, III2 und IV konnten mit großer Präzision in die Dichtekarte eingepasst werden. Die wenigen kleinen Unterschiede zwischen Röntgenstrukturen und EM-Dichtekarte sind auf leichte Konformations-änderungen zurückzuführen. Die Kryo-EM-Rekonstruktion ist erheblich größer als die Rekonstruktion aus Negativfärbung, wodurch die enthaltenen Komplexe nur noch wenige punktuelle Kontakte haben. In den Zwischenräumen könnte eine spezielle Lipidumgebung die kleinen Elektronenüberträger Ubichinon und Cytochrom c in den Superkomplex integrieren. Ihre Bindestellen sind jeweils zueinander orientiert und die geringen Abstände, die zum ersten Mal bestimmt werden konnten, stützen die Hypothese eines gerichteten Substrattransfers über kurze Entfernungen. Von den möglichen Übertragungswegen scheint der kürzere mit weniger Transferreaktionen bevorzugt zu werden. Während der Entwicklung des neuen Reinigungsprotokolls für die Superkomplexe konnte zusätzlich eine neue Methode zur Rekonstitution von Membranproteinen entwickelt werden. Die solubilisierten Proteine werden dabei in Dichtegradienten mit steigenden Konzentrationen von ansolubilisierten Liposomen und Cyclodextrin zentrifugiert, wodurch ihnen langsam das Detergens entzogen und durch Lipid ersetzt wird. Proteoliposomen werden gleichzeitig von überschüssigem Lipid und Cyclodextrin-Detergens-Komplexen getrennt.
• The respiratory chain in the inner membrane of mitochondria consists of five large multi-enzyme complexes. The NADH-dehydrogenase (I), succinate dehydrogenase (II, indirectly), cytochrome c-reductase (III) and cytochrome c-oxidase (IV) utilize the energy from electron transfer to establish a proton gradient across the inner mitochondrial membrane. This gradient is subsequently used by the FOF1-ATP synthase (V) as energy source for the phosphorylation of ADP. For a long time there was a controversy, how these proteins are arranged in the membrane. According to the random collision model they diffuse freely as single entities that meet only at random events, whereas in the solid-state model they form larger functional assemblies. In the last years there was growing evidence that the latter model might be the correct one. Indeed, so-called supercomplexes of the respiratory chain could be isolated in an active form. Eventually, in 2007 the first three-dimensional reconstruction by electron microscopy of a supercomplex consisting of complex I, dimeric complex III and complex IV was published. But due to the limits of the used negative stain method this structure was of low resolution and suffered from artifacts like shrinking caused by dehydration. Because of this, the structures of the individual complexes could be only roughly fitted. To circumvent these problems it was necessary to obtain a structure by cryo EM. To obtain the higher yield and protein concentration needed for cryo-EM, a new purification scheme was established. The key steps are the replacement of the digitonin used for the solubilization by Amphipol A8-35 utilizing ?-cyclodextrin and subsequent density gradient ultracentrifugation. In BN-PAGE supercomplexes purified in this way exhibited the same band and activity pattern as samples in digitonin. Also in single particle analysis of a negatively stained sample no structural differences were observed. But beside similar orientations as known from the previous study, some new views were discovered that could not be assigned and maybe represented a contamination with larger supercomplexes. Even by purification in amphipols the protein concentration could not be significantly increased. Furthermore, it was not possible to embed the supercomplexes in vitrified buffer in the holes of holey carbon film as usually required for cryo EM. Instead, the proteins were vitrified in a thin layer of buffer on a continuous carbon support film. As the supercomplexes adopt a limited number of preferred orientations on the carbon film, this was supposed to help distinguish different populations of supercomplexes. A first three-dimensional reconstruction was generated by the random conical tilt approach. This initial model was subsequently refined by projection matching to a resolution of 19 Å, which is almost twice as much as for the previous one from negative stain (36 Å). The structure represents a native state and shows details like individual domains, gaps between domains and a strong curvature of the membrane arm of complex I that were previously not visible. The amphipols form a belt around the trans-membrane region. The X-ray structures of the individual complexes I, III2 and IV were placed into the density map with high precision. The few small differences between the X-ray structures and the EM density map can be attributed to slight changes in conformation. The cryo-EM reconstruction is considerably larger than the reconstruction from negative stain. Therefore there are only few focal contacts between the individual complexes. In the gaps in between a special lipid environment might integrate the small electron carriers ubiquinone and cytochrome c into the supercomplex. Their binding sites are oriented towards each other and the short distances between them that could be determined for the first time, support the hypothesis of a directed substrate transfer over short distances. Of the possible transfer pathways the shorter one with less transfer reactions seems to be preferred. During the development of the new purification protocol for the supercomplexes, additionally, a new method for the reconstitution of membrane proteins was developed. The proteins are centrifuged into a density gradient with increasing concentrations of liposomes at the onset of solubilization and cyclodextrin. During centrifugation the detergent is gradually removed from the solubilized proteins and at the same time replaced by lipid. Proteoliposomes are separated from excess lipid and cyclodextrin-detergent-complexes.