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High-resolution cryo-electron microscopy study of structure anddynamics of yeast fatty acid synthase by single particle analysis

  • This thesis presents a 5.9 Å map of yeast FAS obtained by cryo-electron microscopy using single particle analysis (SPA). The EM-map has been analyzed both by quantitative and qualitative analysis to aid in understanding of the structure and dynamics of yeast FAS. This study approaches the factors limiting the resolution in EM (>20 Å) and further discusses the possibilities of achieving higher-resolutions (<10 Å) in cryo-EM by single particle analysis. Here, SPA is highlighted as a powerful tool for understanding the structure and dynamics of macro-molecular complexes at near native conditions. Though SPA has been used over the last four decades, the low-resolution range (20-30 Å) of the method has limited its use in structural biology. Over the last decade, sub nanometer resolution (<10 Å) structures solved by SPA have been reported --both in studies involving symmetric particles, such as GroEL (D7) and asymmetric particles, such as ribosomes (C1). Recently, near-atomic resolution in the range of 3.8-4.2 Å has been achieved in cases of highly symmetric icosahedral viral capsid structures as well. The yeast FAS structure (D3) presented here is one of two low symmetry structures submitted to the EM-database in a resolution range of 5-6 Å; the other being GroEL (D7). Fatty acid synthase (FAS) is the key enzyme for the biosynthesis of fatty acids in living organisms. There are two types of FAS, namely the type II FAS system in prokaryotes, consisting of a set of individual enzymes, and type I FAS found in eukaryotes as a multienzyme complex. Yeast fatty acid synthase (FAS) is a 2.6 MDa barrel-shaped multienzyme complex, which carries out cyclic synthesis of fatty acids. By electron cryomicroscopy of single particles we obtained a 3D map of yeast FAS at 5.9 Å resolution. Compared to the crystal structures of fungal FAS, the EM map reveals major differences and new features that indicate a considerably different arrangement of the complex in solution, as well as a high degree of variance inside the barrel. Distinct density regions in the reaction chambers next to each of the catalytic domains fit well with the substratebinding acyl carrier protein (ACP) domain. In each case, this resulted in the expected distance of ~18 Å from the ACP substrate binding site to the active site of the catalytic domains. The multiple, partially occupied positions of the ACP within the reaction chamber provide direct insight into the proposed substrate-shuttling mechanism of fatty acid synthesis in this large cellular machine.
  • Die Fettsäure Synthase (FAS) ist das Schlüsselenzym bei der Biosynthese von Fettsäuren in lebenden Organismen. Zwei Arten der FAS sind bekannt. Der Typ-II FAS der Prokarioten ist aus verschiedenen Einzelenzymen aufgebaut, während der Typ-I FAS der Eukarioten aus einem Multi-Enzym Komplex besteht (Smith et al., 2003). Der Typ-I FAS Komplex der Säugetiere ist ein a2-Homodimer (Brink et al., 2002), der Typ-I FAS Komplex der Bäckerhefe wird dagegen aus einem a6b6 Heterododecamer aufgebaut, der eine molekulare Masse von 2,6 MDa besitzt (Brink et al., 2002). Obwohl Pilz- und Säugertyp FAS deutlich unterschiedliche Strukturen aufweisen, sind alle, zur Synthese von Fettsäuren notwendigen Enzyme (Fig. 1), in beiden FAS-Komplexen konserviert. Früheren elektronenmikrokopischen Untersuchungen (Kolodziej et al., 1996) zeigten die FAS als eine 260 Å x 230 Å Fass-ähnliche Struktur mit D3 Symmetrie. Die dreidimensionalen Röntgenkristallstrukturen der Thermomyces lanuginosus (Jenni et al., 2007) und S. cerevisiae FAS bei einer Auflösung von 3,1 Å beziehungsweise 4,0 Å (Leibundgut et al., 2007; Lomakin et al., 2007; Johansson et al., 2008) weisen kaum Unterschiede auf. Die sechs a-Untereinheiten der FAS bauen ein äquatoriales Rad auf, das die fassartige Struktur in zwei separate Kuppeln aufteilt. Die Kuppeln wiederum bestehen aus jeweils drei b-Untereinheiten. Die a- und b-Untereinheiten bilden pro Kuppel drei Reaktionsräume mit acht Reaktionszentren. Für die Reaktionszentren stellt die a-Untereinheit die Phosphopentetheinyl-Transferase (PPT), das Acyl-Carrier-Protein (ACP), die Ketoacyl-Synthase (KS), die Ketoacyl-Reduktase (KR) und einen Teil der Malonyl-Palmitoyl-Reduktase (MPT)-Domäne bereit. Die Acetyl-Transferase (AT), die Enoyl-Reduktase (ER), die Dehydratase (DH) sowie der Hauptteil der MPT wird von der b-Untereinheit eingebracht. In der Pilztyp FAS wird das ACP durch zwei flexible Verbindungsstücke gehalten, die es mit der MPT-Domäne und dem Zentrum des äquatorialen Rads verbindet. Die Verbindungsdomänen definieren den Reaktionsradius des ACP, der weitgehend mit dem Reaktionsraum übereinstimmt (Leibundgut et al., 2007). Die Reaktionsbereiche aller katalytischen Domänen, ausgenommen die der PPT, weisen in Richtung Reaktionsraum im Inneren der FAS (Leibundgut et al., 2007; Lomakin et al., 2007; Johansson et al., 2008). Zusätzlich zu den Reaktionsdomänen, existieren weitere sechs Strukturdomänen, zwei in der a-Untereinheit (SD1-2a) und vier in der b-Untereinheit (SD1-4b). Kürzlich veröffentliche Studien konnten zeigen, dass jeder Reaktionsraum unabhängig von einander arbeitet (Singh et al., 2008). Das ACP gehört zu der Klasse der universal vorkommenden, hochkonservierten Carrier-Proteine, die Acyl-Zwischenprodukte über den ~18 Å langen Phosphopantetheinarm binden und in sehr unterschiedlichen metabolischen Reaktionen, einschließlich denen der Biosynthese von Polyketiden oder Fettsäuren (Byers and Gong, 2007), activ sind. Die ACP werden in zwei Klassen, Typ-I und Typ-II, eingeteilt, die beide a-helicale Strukturen mit einer konservierten, zentralen vier-Helix Anordnung besitzen. Die vier- Helix Anordnung stellt die Bindestelle für die Acylketten-Zwischenprodukte zur Verfügung. ACP-abhängige Enzymreaktionen sind essentiell für jede Zelle. Daher ist die Pilztyp FAS eine wichtiges Angriffstelle medikamentöser Behandlung (Byers und Gong, 2007). ...

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Metadaten
Author:Preeti Kumari
URN:urn:nbn:de:hebis:30-77056
Referee:Werner KühlbrandtORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2010/05/03
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2010/04/09
Release Date:2010/05/03
HeBIS-PPN:223588164
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht