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Giang Ngo

• Lipopolysaccharide (LPS) is a major glycolipid component in the outer leaflet of the outer membrane of Gram-negative bacteria and known as endotoxin exhibited by the lipid A moiety, which serves as a membrane anchor. The effective permeability barrier properties of the outer membrane contributed by the presence of LPS in the extracellular layer of the outer membrane confer Gram-negative bacteria a high resistance against hydrophobic compounds such as antibiotics, bile salts and detergents to survive in harsh environments. The biogenesis of LPS is well studied in Escherichia coli (herewith E. coli) and the LPS transport (Lpt) is carried out by a transenvelope complex composed of seven essential proteins (LptABCDEFG), which are located in the three compartments of the cell such as the outer membrane, the inner membrane and the periplasm. The Lpt system also exists in Anabaena sp. PCC 7120 (herewith Anabaena sp.), however, homologues of LptC and LptE are still missing. BLAST search failed to identify a homologue of LptC, in contrast, the secondary structure analysis using the Pfam database based on the existing ecLptC secondary structure identified one open reading frame All0231 as the putative Anabaena sp. homologue of LptC, which is designated anaLptC. Despite the low sequence similarity, the secondary structure alignment between anaLptC and ecLptC using the HHpred server showed that both proteins share high secondary structural similarities. The genotypic analysis of the insertion mutant anaLptC did not identify a fully segregated genome and its phenotypic analysis revealed that it was sensitive against chemicals, suggesting that the analptC gene is essential for the growth of Anabaena sp. and involved in the outer membrane biogenesis. This is further supported by the observation of the small cell phenotype in the anaLptC mutant via transmission electron microscopy. Moreover, physical interactions between the anaLptC periplasmic domain with anaLptA as well as with anaLptF were established, indicating that the anaLptC periplasmic domain is correctly folded and alone functional and that the transmembrane helix is not required for the interaction with anaLptA and anaLptF. Furthermore, the reduction of the O-antigen containing LPS was observed in the insertion mutant anaLptC and the dissociation constant Kd of the anaLptC periplasmic domain for ecLPS was determined.The three-dimensional structure of the periplasmic domain of anaLptC was solved by X-ray crystallography with a resolution of 2.8 Å. The structural superposition between the ecLptC crystal structure (PDB number 3my2) and the crystal structure of anaLptC periplasmic domain obtained by this study showed the similarity in the folding of the two proteins with a Cα r.m.s.d value of about 1 Å and confirmed that the length of anaLptC is more than two times longer than that of ecLptC. The structural comparison also revealed that both structures share the typical β-jellyroll fold and conserved amino acids, which were shown in ecLptC to bind to LPS in vivo and found in anaLptC. Overall, these data strongly suggest that anaLptC is involved in the transport of LPS and support the model whereby the bridge spanning the inner membrane and the outer membrane would be assembled via interactions of the structurally conserved β-jellyroll domains shared by five (LptACDFG) out of seven Lpt proteins.
• Die äußere Membran, der periplasmatische Raum, der das dünne Peptidoglykan enthält, und die innere Membran sind drei Zellkompartimente der Gram-negativen Bakterienzellhülle. Die äußere Membran ist eine einzigartige asymmetrische Doppelschicht mit der inneren Schicht aus Phospholipiden und der extrazellulären Schicht aus Lipopolysacchariden (LPS). Dagegen ist die innere Membrane symmetrisch und besteht aus Phospholipiden. LPS ist als Endotoxin bekannt, welches als hitzestabiles Gift von verschiedenen pathogenen Gram-negativen Bakterien produziert wird und erstmals Ende des 19. Jahrhunderts vom deutschen Arzt Richard Pfeiffer beschrieben wurde. Das Vorhandensein von LPS in der extrazellulären Schicht der äußeren Membrane trägt weitgehend zu den Permeabilitätsbarriereigenschaften bei und ermöglicht es Gram-negativen Bakterien, in toxischen und extremen Umgebungen zu überleben und mehrere Antibiotika auszuschließen, die gegen Gram-positive Bakterien wirksam sind. LPS ist ein Glucosamin Disaccharid mit einen konservierten Lipid A als hydrophober Membrananker, einem inneren und äußeren Kern aus Oligosacchariden und einem langkettigen O-Antigen aus Polysacchariden. Negativ geladene LPS-Moleküle wechseltwirken in vivo mit zweiwertigen Kationen. Dadurch wird eine undurchlässige Schicht hergestellt, um den Zufluss von hydrophoben Molekülen wie Antibiotika, Gallensalzen und Detergenzien in den Zellen zu verhindern. Die LPS-Biogenese ist ein komplexer Prozess. Sie umfasst die Synthese der verschiedenen Einheiten von LPS an der inneren Membran, die Translokation durch die innere Membran, den Transport durch den wässrigen periplasmatischen Raum und die Insertion in der extrazellulären Schicht der äußeren Membrane. Die Biogenese von LPS ist am besten in E. coli beschrieben und findet mit der Produktion von Lipid A zwischen der inneren Membran und Zytosol statt. Das Kern-Oligosaccharid wird anschließend durch das Waa Protein an das Lipid A angehängt. MsbA, ein ABC transporter (ATP-binding cassette transporter) dreht den Komplex aus Lipid A und Kern-Oligosaccharid auf die periplasmatische Seite der inneren Membran um, wo er mit O-Antigen zu Bildung des reifen LPS durch WaaL-Protein ligiert wird. Der Weitertransport des LPS wird von einem transmembranen LPS Transporter Komplex (LptABCDEFG) durchgeführt, welches es über das Periplasma transportiert und in die äußere Membran einfügt. Dabei bilden LptB, LptF und LptG ein Komplex in der inneren Membran verantwortlich für die Extraktion von LPS aus der Membran und die Lieferung auf LptC. Der LptBFG Komplex assoziiert mit LptC, ein bitopisches Protein in der Plasmamembran, welches das LPS an das periplasmatische Protein LptA transferiert. LptA trägt eine OstA Domäne (organic solvent tolerance), welche ebenfalls in LptC und im N-Terminus von LptD vorhanden ist. Das äußere Membranprotein LptD enthält eine C-terminale transmembrane β-Barrel Domäne, die das Lipoprotein LptE bindet. LptE wird nicht nur für den Assemblierung von LptD benötigt, sondern bildet auch eine Plug-Domäne für die β-Barrel-Domäne von LptD. Darüber hinaus dient LptE als Erkennungsstelle für LPS und hilft bei der Assemblierung von LPS in die extrazelluläre Schicht der äußeren Membran. ...