Open Access

Hannah Weißer

• This work investigated the influence of the CRISPR/Cas9 mediated knockout of 5-lipoxygenase (5-LO) on different adherent tumour cell lines derived from solid tumours. For this, the 5-LO expressing tumour cell lines HCT-116, HT-29, and U-2 OS were transiently transfected using a plasmid carrying the CRISPR/Cas9 complex sequence to the ALOX5 gene. Subsequently, cells were selected using Puromycin and analysed via Western blotting and DNA Sanger sequencing. Cells that were transfected with a control plasmid missing the guide RNA sequence, were used as a control for all experiments. Differential gene expression analysis, performed after next-generation RNA sequencing, revealed that the expression of various genes was altered after the knockout of 5-LO. In HCT-116 cells, 28 genes were expressed differentially in all 5-LO knockout single-cell clones, while in HT-29 cells the expression of 18 genes and in U-2 OS cells of 234 genes was influenced by the knockout of 5-LO. These findings were validated by real-time qPCR. A lot of the genes that were influenced by the 5-LO knockout are known to be connected to epithelial-mesenchymal-transition (EMT), a process necessary for tumour metastasis. The results from RNA sequencing were the starting point for further investigations. In the following, different aspects of the tumour cell lines were examined. In HT-29, as well as in U-2 OS cells, it was shown that knockout of the 5-LO resulted in impaired cell proliferation. Also, the formation of three-dimensional tumour spheroids was altered. In HT-29 cells, the knockout of 5-LO increased the number of cells in spheroids. In contrast, in U-2 OS cells, the number of cells per spheroid was decreased, even though the diameter of the spheroids was increased, due to more loosely packed spheroids. The difference between 5-LO positive and negative U-2 OS cells became even more obvious after embedding the spheroids in an artificial extracellular matrix. In that scenario, cells lacking the 5-LO formed smaller spheroids that did not have the same ability to grow into the extracellular matrix as 5-LO positive cells did. Also, directed cell migration was strongly influenced by the knockout of 5-LO. In both, HCT-116 and U-2 OS cells, directed cell migration towards a serum gradient was increased in 5-LO knockout single-cell clones. Pharmacological inhibition of the enzyme was used to investigate, whether canonical or non-canonical functions were responsible for the previously mentioned effects. Therefore, vector control cells were treated with the 5-LO inhibitors Zileuton and CJ-13610 in different concentrations. Interestingly, only some of the effects mediated by the complete knockout of 5-LO could be reproduced by inhibiting the enzyme, leading to the suggestion, that canonical, as well as non-canonical functions of 5-LO, play a role in these tumour cells. To conclude, it was shown in this study, that 5-LO affects various cellular functions when expressed in adherent tumour cell lines. These cell line-dependent effects result in altered gene expression, enhanced proliferation, and spheroid formation, as well as impaired cell motility, and can be mediated by enzymatic activity as well as other non-canonical functions.
• Die 5-Lipoxygenase ist das Schlüsselenzym in der Biosynthese von Leukotrienen. Nach Aktivierung durch unterschiedliche Stimuli transloziert die 5-LO an die Kernmembran, wo sie einen Komplex mit der zytosolischen Phospholipase A2 und dem 5-LO aktivierendenProtein (FLAP) bildet. Dieser aktivierte Komplex setzt die mehrfach ungesättigte Fettsäure Arachidonsäure aus der Membran frei. In einer Zweischritt-Reaktion wird diese anschließend über das Intermediat 5-HpETE (5(S)-Hydroperoxy-6,8,11,14-eicosatetraensäure) zum instabilen Epoxid Leukotrien A4 (LTA4) oxidiert. Leukotrien A4 kann dann entweder durch die LTA4-Hydrolase zu Leukotrien B4 umgesetzt werden, oder es wird durch die LTC4-Synthase an Glutathion gekoppelt, wobei die sogenannten Cysteinyl-Leukotriene C4, D4 und E4 entstehen. Leukotriene vermitteln entzündliche Reaktionen und tragen zum allergischen Geschehen bei Asthma bronchiale und der allergischen Rhinitis entscheidend bei. LTB4 wirkt als potentes Chemokin, wobei Leukozyten rekrutiert werden und deren Anheften an das Gefäßendothel erhöht wird. LTB4 fördert die Erkennung und Beseitigung von Erregern durch Leukozyten und ist somit ein wichtiger Teil des angeborenen Immunsystems. Die Cysteinyl-Leukotriene gehören zu den potentesten bisher bekannten Bronchokonstriktoren und sind maßgeblich am pathologischen Umbau der Atemwege bei entzündlichen Erkrankungen beteiligt. Hier agieren sie wie LTB4 als chemische Lockstoffe und vermitteln das Einwandern von Immunzellen, wodurch das entzündliche Geschehen vorangetrieben wird. Die 5-Lipoxygenase wird vorrangig in verschiedenen Zellen des Immunsystems wie Makrophagen, Mastzellen oder dentritischen Zellen exprimiert. Zusätzlich konnte in den letzten Jahren aber auch die Expression von 5-LO in soliden Tumoren unterschiedlichen Ursprungs, wie Brust-, Pankreas-, Prostata- oder Kolonkarzinomen, gezeigt werden, obwohl all diese Gewebe unter physiologischen Bedingungen keine 5-LO exprimieren. 5-LO-exprimierende Tumore sind charakterisiert durch eine schlechte Prognose hinsichtlich der Überlebensrate der Patient*innen und ein geringeres Ansprechen auf die Behandlung mit zytostatischen Wirkstoffen. Neben der 5-LO selbst, konnten auch die unterschiedlichen Produkte der 5-LO in Tumoren nachgewiesen werden und durch die Inhibition der 5-LO konnten Zellzyklusarrest und Apoptose ausgelöst werden. Die in den unterschiedlichen Studien verwendeten Konzentrationen der Inhibitoren lagen jedoch teilweise weit über dem IC50 Wert für die 5-LO, was es fraglich macht, ob diese Effekte allein durch die Hemmung der 5-LO zustande kamen. Nichtsdestotrotz stellt sich bis heute die Frage, warum diese soliden Tumore 5-LO exprimieren. Neben ihrer eigentlichen Produktion von Lipidmediatoren, kann die 5-LO auch weitere Strukturen oxidieren, wobei reaktive Sauerstoffspezies entstehen, die die Zelle erheblich schädigen können. Es birgt also ein gewisses Risiko, dieses Enzym zu exprimieren, wodurch es nur logisch erscheint, dass die 5-LO diesen Tumorzellen einen Vorteil verschaffen muss und die Aktivität der 5-LO streng reguliert wird. Neben ihrer gewöhnlichen kanonischen, also der enzymatischen, Funktion sind noch weitere nicht-kanonische Funktionen der 5-LO bekannt. So konnten Interaktionen mit p53, β-Cathenin und dem microRNA prozessierenden Protein DICER, sowie die Regulation der Transkription in Mono Mac 6 Zellen gezeigt werden. Über diese nicht-kanonischen Funktionen ist es denkbar, dass die 5-LO weitere zelluläre Prozesse jenseits der Synthese von Lipidmediatoren beeinflusst. In vorherigen Arbeiten, größtenteils durchgeführt durch Tamara Göbel, wurde die Expression der 5-LO in Tumorzelllinien, die von soliden Tumoren unterschiedlichen Ursprungs entstammen, untersucht, wobei HCT-116, HT-29 (Kolonkarzinom), Capan-2 (Pankreaskarzinom) und U-2 OS (Osteosarkom) Zellen allesamt die 5-LO exprimierten. Zusätzlich wurde die Expression weiterer Proteine, die an der Biosynthese der Lipidmediatoren beteiligt sind (FLAP, cPLA2, LTA4-Hydrolase und LTC4-Synthase), auf Protein- oder mRNA-Ebene bestätigt. Bei Aktivitätsmessungen wurde die Bildung von 5-HETE und LTB4 durch intakte Zellen, Zellhomogenate und zusätzlich den S100 (100.000 x g) Überständen der Homogenate untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die Lipidmediatorproduktion in allen 4 Zelllinien in intakten Zellen sehr gering ist und durch das Homogenisieren der Zellen erhöht werden kann. In HT-29, HCT-116 und U-2 OS Zellen bleibt die Menge der gebildeten Substrate jedoch trotzdem deutlich unter derer, die von PMNL unter vergleichbaren Bedingungen gebildet wurde. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Aktivität der 5-LO in den Tumorzellen gehemmt wird. Da bekannt ist, dass die Lokalisation der 5-LO einen starken Einfluss auf deren Aktivität hat, wurde mittels Konfokal-Mikroskopie die zelluläre Verteilung der 5-LO untersucht...