Open Access

Stefan Mate Vlaho

• Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die Analytik der Neurotransmitterbestimmung im Liquor zu etablieren und in das vorhandene Leistungsspektrum des Stoffwechsellabors zu integrieren. Die klinische Ausrichtung gilt sowohl der Detektion primärer Neurotransmitterdefekte als auch der Untersuchung der Ursachen und Auswirkungen sekundärer Neurotransmitterstörungen. Die Messung der Biogenen Amine im Liquor mittels der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie in dem hier vorgestellten Verfahren konnte standardisiert und in das vorhandene Leistungsspektrum des Stoffwechsellabors des Zentrums für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der J.W. Goethe-Universität, Frankfurt etabliert werden. Es ist nachgewiesenermaßen sensitiv, spezifisch und erlaubt eine schnelle und reproduzierbare Analyse bei minimaler Probenmenge und Probenaufarbeitung. Meßtechnisch konnte durch den von unserer Arbeitsgruppe verwendeten ESA CoulArray® Detektor (Modell 5600) (im Gegensatz zu den bisher beschriebenen amperometrischen Detektoren) aufgrund seiner 16 einzelnen coulometrischen Sensoren eine enorme Verbesserung der Nachweisqualität der untersuchten Neurotransmittersubstanzen erreicht werden. Aufgrund verschiedener Potentialfelder ist eine spezifische Detektion über einen weiten Einsatzbereich aufgrund der elektrochemischen Unterschiede zu erzielen. Dies ermöglicht eine wesentlich größere Anzahl zu detektierender Substanzen eindeutig zu identifizieren und erlaubt damit nicht nur die eindeutige Zuordnung der zu messenden Endabbauprodukte HVA und 5HIAA, sondern auch des gesamten Spektrums der vorgeschalteten Metabolite. Somit ließ sich mit diesem aufgebauten Analysesystem die komplexe vollständige Abbildung des Stoffwechselwegs der zentralen biogenen Amine verwirklichen. Die sehr sensible Messung der Parameter stellt große Anforderung an Probengewinnung, Probenverarbeitung und Meßanalyse. Aufgrund der Durchführung interner Qualitäskontrolluntersuchungen konnte der Nachweis einer sicheren reproduzierbaren Analytik erbracht werden. Insbesondere die Notwendigkeit der ausreichenden Unterdrückung der weiter ablaufenden chemischen Prozesse durch die unmittelbare Kühlung der Liquorproben auf eine Temperatur von -80°C wurde nachgewiesen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von handelsüblichen EDTA-Röhrchen einen ausreichenden antioxidativen Schutz bietet und wir somit eine anwenderfreundliche Probengewinnung empfehlen können. Die strikte Einhaltung des Protokolls zur Gewinnung und weiteren Verarbeitung der Liquorproben ist elementar und stellt insbesondere bei zur Zeit noch bestehenden uneinheitlichen altersabhängigen Referenzwerten die Grundlage zur diagnostischen Bewertung der gemessenen Werte dar. Eine Standardisierung der Referenzwerte auf internationaler Ebene ist unverzichtbar zur korrekten Interpretation der gemessenen Daten und sollte vorrangiges Streben aller beteiligten Laboratorien sein. Ein entsprechender Antrag auf ein erneutes, jährlich stattfindendes externes Qualitätskontrollprogramm (Ringversuch) wurde gestellt. Mit der Bestimmung der Biogenen Amine im Liquor steht ein potentes Instrument zur Detektion pädiatrischer Neurotransmittererkrankungen zur Verfügung. Es gibt weltweit jedoch nur eine geringe Anzahl von Laboratorien mit diesem Analyseangebot. Somit trägt die Etablierung dieser Analytik im vorhandenen Leistungsspektrum des Stoffwechsellabors des Zentrums für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der J.W. Goethe-Universität, Frankfurt dazu bei diese Lücke zu schließen. In der Mehrzahl sind Erkrankungen der zentralen Biogenen Amine ausschließlich nur über eine Messung der Metaboliten im Liquor diagnostizierbar, nur wenige angeborene Neurotransmitterdefekte fallen durch periphere Serumparameter, wie z.B. einer Hyperphenylalaninämie auf. Es ergibt sich der Verdacht, dass diese Erkrankungsformen unterdiagnostiziert sind und auch das Wissen um diese Erkrankungen nicht allgemein vorausgesetzt werden kann. Mit den Neurotransmittervorstufen (z.B. L-Dopa oder 5OH-Tryptophan) steht betroffenen Patienten eine adäquate Therapieoption zur Verfügung, so dass die Aufdeckung eines spezifischen Defektes in der Synthese der Biogenen Amine vorrangiges Ziel sein müsste. Exemplarisch für die beeindruckende Effektivität der Therapie mittels L-Dopa und 5OH-Tryptophan sei auf den Erfahrungsbericht des von unserer Arbeitsgruppe betreuten Patienten mit 6-PTPS-Defekt verwiesen. Zusätzlich konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass die wiederholenden Messungen dem Therapiemonitoring dienen und eine unverzichtbare Grundlage der individuellen Therapie betroffener Patienten darstellen. Sekundäre Veränderungen der Neurotransmission sind beschrieben, jedoch fehlen weitergehende Untersuchungen zur Einordnung ihrer klinischen Relevanz. Gerade diese große inhomogene Patientengruppe stellt eine zukünftige Herausforderung für weitere wissenschaftliche Anstrengungen in diesem Bereich dar. Wie anhand des Beispiels der Patienten mit mitochondrialer Enzephalopathie dargestellt, kann die vorhandene Analysemethode dazu beitragen das Wissen um die Pathophysiologie bekannter Erkrankungen zu erweitern. Da analog zu den primären Erkrankungen auch hier Therapieoptionen zur Verfügung stehen würden, ist es dringend notwendig die übliche Liquordiagnostik diesbezüglich auszudehnen. Aufgrund der auch im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten kann gefolgert werden bei ungeklärten neuropädiatrischen Erkrankungen, besonders jenen, welche in der Neonatal- oder frühen Säuglingszeit beginnen und progredient verlaufen, und sich klinisch durch Dyskinesien, Krampfanfälle und Enzephalopathien äußern, eine Liquoruntersuchung auf Biogene Amine zu veranlassen. Somit dient die erbrachte Arbeit zur Etablierung der Analytik der Neurotransmitterbestimmung im Liquor dem Erkenntnisgewinn neuer metabolischer Erkrankungen, erweitert das Grundlagenwissen bekannter Störungen und dient der Detektion seltener, jedoch oft schwerwiegender Erkrankungen.
• The aim of this investigation was to develop a method for the analysis of neurotransmitters in CSF and to integrate this assay within the analytical spectrum of the metabolic laboratory. The clinical relevance was seen as detecting not only primary neurotransmitter defects, but also to investigate the cause and effects of secondary alterations in neurotransmitter metabolism. The quantitative determination of biogenic amines in CSF using high-performance liquid chromatography (HPLC) was standardised and incorporated into the routine analytical spectrum of the Metabolic Laboratory of the Centre for Paediatric and Adolescent Medicine, Johann-Wolfgang-Goethe University in Frankfurt am Main. The method is sensitive, specific and provides a rapid and reproducible result using both a minimal sample volume and handling. A superior detection of neurotransmitters was achieved using the ESA Coularray Detector (Model 5600) compared to the hitherto described amperometric detectors. This model uses 16 single coulometric sensors and because of the various potential fields, we could detect specific substances over a wide range of electrochemical charge differences. This enabled us to detect and identify a wide variety of compounds, not only the end-products homovanillic acid and 5-hydroxyindole acetic acid, but also the whole range of metabolic precursors. With this system, we were able to investigate the complete and complex metabolic pathways of biogenic amines. The high sensitivity of this analysis necessitated much attention with regard to sampling, sample handling and analysis. The reproducibility of the analysis was confirmed using an internal quality control. The immediate freezing of samples and storage at -80°C was shown to be necessary to stop further metabolic processes. We could also show that the use of commercial EDTA blood collection tubes provided sufficient anti-oxidative protection, thus making the drawing of samples considerably easier. The strict adherence to sampling and storage protocols is of utmost importance for determining age-related reference ranges at a time when controversy exists concerning the hitherto published ranges. An international consensus is necessary in order to compare and interpret results and should be the aim of all laboratories offering this service. To this end, we have applied to join an international external quality control scheme. The analysis of biogenic amines in CSF enables the detection of patients with disorders of neurotransmitter metabolism. There are very few laboratories worldwide providing this service and the establishing of this method in Frankfurt has increased the diagnostic capability of the laboratory. The majority of patients with disorders of neurotransmitter metabolism can only be diagnosed using this CSF analysis, although a few may be diagnosed due to secondary abnormalities in serum (e.g. hyperphenylalaninaemia). Disorders of neurotransmitter metabolism are definitely under-diagnosed and this reflects our lack of knowledge in this area. The administration of neurotransmitter precursors (e.g. L-dopa or 5- hydroxytryptophan) offer affected patients a therapeutic option, therefore the primary aim is to identify a specific defect in biogenic amine synthesis. We could show the effectiveness of this therapy in our patients with 6-PTPS deficiency and that routine neurotransmitter monitoring is vital for individual therapeutic success. Secondary changes in neurotransmitter metabolism have been reported; however, further investigations are lacking to confirm their clinical relevance. This is a particularly large area for future research. Using the example of patients with mitochondrial encephalopathy, we can see that this analytical tool can increase our knowledge of the pathophysiology. As with primary disorders of neurotransmission, therapeutic options would be available and it is vital that the CSF analysis be broadened. It must be recommended that a neurotransmitter analysis be included in the diagnostic work-up of neuropaediatric patients who develop progressive disease with symptoms of dyskinesis, seizures and encephalopathy. The development and application of neurotransmitter analysis in CSF has opened a door to new metabolic diseases, increased our knowledge of pathophysiology and is a valuable tool for the detection of these rare, but often highly complex, disorders.