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Jürgen Breitenbach

• Erstmals konnte eine z­Carotin­Desaturase einer höheren Pflanze nach heterologer Expression in E. coli in nativer Form gereinigt und enzymatisch charakterisiert werden. Dazu wurde die cDNA der Capsicum­ZDS in einen Expressionsvektor kloniert, der die ZDS als rekombinantes Polypeptid mit 6 N­terminalen Histidinen exprimierte. Dadurch konnte das Enzym in nur zwei Schritten über eine Kombination von Ammoniumsulfatfällung und Metallionen­Affinitätschromatographie selektiv aus E. coli separiert werden. Die ZDS wurde ohne eine mutmaßliche Transitsequenz als ein Polypeptid von 59 kDa exprimiert. Das pH­ Optimum der ZDS­Aktivtität liegt bei 7,2 in der Nähe der rechnerisch ermittelten pI­Wertes von 7,4. Die ZDS führt zwei Desaturierungsschritte ausgehend von z­Carotin zu Lycopin als ein monomeres Protein durch. Unter Verwendung des Two­Hybrid­Systems, einer Gelelektrophorese unter nativen Bedingungen und einer Gelfiltration der nativen ZDS, konnte gezeigt werden, daß die ZDS als Monomer und als Dimer vorliegen kann. Die Dimerisierung der ZDS ist jedoch für deren enzymatischer Aktivität und für die Durchführung beider Desaturierungsschritte nicht notwendig. Für die Substratcarotinoide z­Carotin und Neurosporin, wurden die Km ­Werte von 8,4 µM und 9,0 µM bestimmt. Die Capsicum­ZDS zeigt von ihrer Aminosäuresequenz her eine große Ähnlichkeit zu den cyanobakteriellen z­Carotin­Desaturasen und eine geringere Ähnlichkeit zu den pflanzlichen Phytoendesaturasen. Eine diskutierte phylogenetische Verwandtschaft der z­Carotin­ und Phytoendesaturase aus höheren Pflanzen und Cyanobakterien wird durch die Verwendung des gleichen Kofaktors Plastochinon und durch die gemeinsame Hemmbarkeit mit den z­Carotin­Desaturase­Hemmstoffen J852 und LS80707 unterstützt. Eine Kofaktoruntersuchung ergab, daß Plastochinon sowohl der Kofaktor der ZDS aus Capsicum, als auch der Phytoendesaturasen aus Gentiana lutea (gelber Entian), aus dem Cyanobakterium Synechococcus sp. PCC 7942, sowie der z­ Carotin­Desaturase aus Synechocystis sp. PCC 6803 ist. Der Km ­Wert von Decyl­ Plastochinon wurde für die Capsicum­ZDS zu 0,4 µM bestimmt. Der Kofaktor der z­ Carotin­Desaturase Plastochinon, sowie die Entdeckung einer plastidären terminalen Oxidase (Carol et al., 1999) ermöglicht die Entwicklung eines Modells der Übertragung der bei der Desaturierung von z­Carotin gewonnenen Elektronen über Plastochinon auf Sauerstoff, wie es bereits für die pflanzliche Phytoendesaturase postuliert wurde (Carol