Funktionelle Analyse des Zytomegalievirus-Proteins US6

  • Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
  • The human cytomegalovirus (HCMV) belongs to the beta-herpesviridae. After an asymptotic primary infection HCMV persists lifelong in the human host. Up to 80% of the human population is infected. During evolution several herpes viruses developed different strategies to evade the human immune response. The HCMV-encoded protein US6 interferes with the antigen processing pathway. The inhibitor is a type I transmembrane protein consisting of a leader sequence, ER-luminal domain, transmembrane helix and a short cytoplasmic tail at the C-terminus. US6 inhibits the TAP-dependant peptide transport from the cytoplasm into the lumen of the ER. Within this PhD thesis the ER luminal domain of US6 consisting of the amino acid residues Asn20-Phe146 was hetererologeously expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. After refolding US6(20-146) is a monomeric protein with a molecular mass of 15,6 kDa. A network of four intramolecular disulfide bonds is formed by eight cysteines within the ER luminal domain of US6. To analyze the molecular mechanism of TAP inhibition several in vitro assays were applied. Binding of US6(20-146) to the short ER-luminal loops within the TMD of TAP inhibits ATP-binding to the cytoplasmic NBD of TAP. However, binding of ADP and peptide is not affected. Inhibition of ATP binding blocks peptide-induced ATP hydrolysis of TAP. As a consequence no energy can be provided to drive the transport process. The IC50 of the inhibition process was determined as 1 µM. The C-terminal region Asn126-Leu139 of the ER luminal domain of US6 is critical for its function. Single amino acids within this region (Cys127, Cys129, D130, W134 and R138) were mutated to serine or alanine. Mutation of these residues had no effect on the activity of US6(20-146). In addition it was shown that the N-terminus is not essential for function.

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Metadaten
Author:Christoph Kyritsis
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000004585
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2004/10/25
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2004/03/31
Release Date:2004/10/25
HeBIS-PPN:124311539
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht