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Daphne Nikles

• Prion diseases, also called transmissible spongiform encephalopathies, are a group of fatal neurodegenerative conditions that affect humans and a wide variety of animals. To date there is no therapeutic or prophylactic approach against prion diseases available. The causative infectious agent is the prion, also termed PrPSc, which is a pathological conformer of a cellular protein named prion protein PrPc. Prions are thought to multiply upon conversion of PrPc to PrPSc in a self-propagating manner. Immunotherapeutic strategies directed against PrPc represent a possible approach in preventing or curing prion diseases. Accordingly, it was already shown in animal models, that passive immunization delays the onset of prion diseases. The present thesis aimed at the development of a candidate vaccine towards the active immunization against prion diseases, an immune response, which has to be accompanied by the circumvention of host tolerance to the self-antigen PrPc. The vaccine development was approached using virus-like particles (retroparticles) derived from either the murine leukemia (MLV) or the human immunodeficiency virus (HIV). The display of PrP on the surface of such particles was addressed for both the cellular and the pathogenic form of PrP. The display of PrPc was achieved by either fusion to the transmembrane domain of the platelet derived growth factor receptor (PDGFR) or to the N-terminal part of the viral envelope protein (Env). In both cases, the corresponding PrPD- and PrPE-retroparticles were successfully produced and analyzed via immune fluorescence, Western Blot analysis, immunogold electron microscopy as well as by ELISA methods. Both, PrPD- and PrPE-retroparticles showed effective incorporation of N-terminally truncated forms of PrPc but not for the complete protein. PrPc at this revealed the typical glycosylation pattern, which was specifically removed by a glycosidase enzyme. Upon display of PrPc on retroparticles the protein remained detectable by PrP-specific antibodies under native conditions. Electron microscopy analysis of PrPc-variants revealed no alteration of the characteristic retroviral morphology of the generated particles. MLV-derived PrPD-retroparticles were successfully used in immunization studies. Contrary to approaches using bacterially expressed PrPc, the immunization of mice resulted in a specific antibody response. The display of the pathogenic isoform was aimed by two different strategies. The first one was directed at the conversion of the proteinase K (PK) sensitive from of PrP on the surface of PrPD-retroparticles into the PK resistant form. Albeit specific adaption of the PK digestion assay detecting resistant PrP, no PrP conversion was observed for PrPD-retroparticles. The second approach utilized a replication competent variant of the ecotropic MLV displaying PrPc on the viral Env protein. This MLV variant was stable in cell culture for six passages but did not replicate on scrapie-infected, PrPSc-propagating neuroblastoma cells. Thus, besides PrPc-displaying virus-like particles a replication competent MLV variant was obtained, which stably incorporated PrPc at the N-terminus of the viral Env protein. The incorporation of the cell-surface located PrPc into particles was expected from previously obtained data on protein display in the context of retrovirus-derived particles. Thus, the lack of incorporation observed for the complete PrPc sequence was rather unexpected and was found to be inhibited at both, fusion to PDGFR and the viral Env. In contrast to N-terminally truncated PrPc, the complete PrPc was shown to exhibit increased cell surface internalization rates and half-life times eventually contributing to the observed results. The PrP-vaccination approach described in this work represents the first successful system inducing PrP-specific antibody responses against the prion protein in wt mice. Explanations at this are based on the induction of specific T cell help or effects of the innate immunity, respectively. MLV-and HIV-derived particles bearing the PrP-coding sequence or being replication competent variants generated during this thesis might help to further improve the PrP-specific immune response.
• Prionenerkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, zu denen Scrapie beim Schaf, Bovine Spongiforme Enzephalopathien beim Rind und beispielsweise die Creutzfeld-Jakob-Erkrankung beim Menschen zählen. Bei dem Erreger der Erkrankung handelt es sich um ein infektiöses Protein, das sogenannte Prionen Protein PrPSc. Die primäre Sequenz des PrPSc ist identisch zur Sequenz eines weit verbreiteten zellulären Proteins PrPc. Es wird angenommen, dass die Vermehrung durch die Umfaltung des zellulären Gegenspielers PrPc stattfindet. Als möglicher therapeutischer Ansatz gegen diese Erkrankungen wird eine Vakzinierung diskutiert. Eine krankheitsverlangsamende Wirkung durch passive Immunisierung mit spezifischen Antikörpern, die die zelluläre Form des Proteins PrPc erkennen, wurde bereits im Tiermodell gezeigt. Die Erzeugung einer Immunantwort gegen PrPc erfordert die Umgehung der wirtsspezifischen Toleranz gegen das Selbstantigen PrPc. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Impfstoffkandidaten für eine aktive Immunisierung gegen Prionenerkrankungen. Es wurden Vakzine auf der Basis von Virus-ähnlichen Partikeln (Retropartikel) entwickelt, die vom murinen Leukämievirus (MLV) bzw. vom humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleitet wurden. Sowohl die Präsentation der zellulären Form PrPc als auch der pathogenen Form PrPSc wurde adressiert. Zur Präsentation auf Retropartikeln wurde PrPc entweder an die Transmembrandomäne des Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor Rezeptors (PDGFR) oder an den N-terminus des retroviralen Hüllproteins (Env) von MLV fusioniert wurde. In beiden Fällen konnten die entsprechenden PrPD- bzw. PrPE-Retropartikel erfolgreich hergestellt werden, die des Weiteren mittels Immunfluoreszenzfärbung, Western Blot Analyse, Immunogold-Elektronen-mikroskopie sowie ELISA Methoden charakterisiert wurden. Sowohl für PrPD- als auch für PrPE-Retropartikel konnte gezeigt werden, dass PrPc inkorporiert und auf der Oberfläche der viralen Partikel präsentiert wurde, wenn N-terminal trunkierte Formen von PrPc verwendet wurden. Die für PrPc typischen Glykosylierungsmuster konnten durch spezifischen Glykosidase-Verdau nachgewiesen werden. Die präsentierten PrPc-Varianten wurden unter nativen Bedingungen von PrP-spezifischen Antikörpern erkannt. Im Gegensatz zu den N-terminal trunkierten Varianten wurde das komplette PrPc nicht in Retropartikel inkorporiert. Mittels Elektronen-Mikroskopie konnte bei der Inkorporation von PrPc-Varianten keine Veränderung der charakteristischen retroviralen Morphologie der Partikel festgestellt werden. MLV-abgeleitete PrPD-Retropartikel wurden anschließend erfolgreich zur Immunisierung von Mäusen eingesetzt. Dabei wurden, im Gegensatz zur Immunisierung mit Vakzinen, die auf bakteriell hergestelltem PrPc basierten, spezifische Antikörpertiter erhalten. Versuche zur Präsentation der pathogenen Form wurden zum einen durch Konvertieren der Proteinase K-sensitiven in die Proteinase K-resistente Form des PrP auf der Oberfläche der PrPD-Retropartikel durchgeführt. Der Nachweis mittels Proteinase K-Verdau wurde hier speziell für virale Partikel adaptiert, die Umwandlung der PrPD-Retropartikel in Proteinase K-resistent Formen konnte jedoch nicht beobachtet werden. Zum anderen wurde ein PrPc-codierendes replikationskompetentes MLV-abgeleitetes Retrovirus erzeugt. Dieses konnte über sechs Passagen genetisch stabil auf murinen Fibroblasten propagiert werden, zeigte allerdings nach Infektion einer Prionen-infizierten Zelllinie, die PrPSc stetig propagierte, keine Replikation. Neben virus-ähnlichen Partikeln standen damit MLV-abgeleitete replikationskompetente Viren zur Verfügung, die PrPc stabil im viralen Genom enthalten und auf ihrem Hüllprotein präsentieren. Basierend auf Hinweisen aus der Literatur war die Inkorporation von PrPc in Virus-ähnliche Partikel zu erwarten, da es sich um ein Zelloberflächenprotein handelt. Der fehlende Einbau des kompletten PrP in retrovirale Partikel war daher unerwartet. Anders als für die trunkierten PrPc-Varianten war sowohl die Fusion mit PDGFR als auch die N-terminale Env-Fusion für PrPc inhibiert. Das komplette PrPc unterliegt im Vergleich zu trunkierten Formen einem erhöhten Zelloberflächen-Umsatz und weist eine geringere Halbwertszeit auf. Diese beiden Faktoren können einen Beitrag zur verminderten Inkorporation in retrovirale Partikel leisten. Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen PrPD-Retropartikel stellen das erste erfolgreiche System zur Erzeugung PrP-spezifischer Immunantworten gegen die native Zelloberflächen-Form des PrPc dar. Ein möglicher Mechanismus zur Erklärung basiert auf der Induktion der T-Zellhilfe sowie eines Beitrags des angeborenen Immunsystems. Eine weitere Verbesserung der Immunantwort sollte sich mit den in dieser Arbeit hergestellten MLV- und HIV-abgeleiteten Partikeln, die zusätzlich mit PrP-codierenden Sequenzen ausgestattet wurden sowie mit den replikationskompetenten MLV-Varianten verwirklichen lassen.