Open Access

Carsten Seckelmann

• Bei einigen Krankheiten bekommt die Knochenmarkstransplantation bzw. die Transplantation peripherer Blutstammzellen als Therapiemöglichkeit eine wachsende Bedeutung. Trotz aller Fortschritte birgt diese Therapieform die Gefahr von schwer zu kontrollierenden Komplikationen (Graft-versus-Host-Krankheit, Host-versus-Graft-Krankheit, lebensbedrohliche Infektionen), die die Behandlungsmöglichkeiten einschränken. Die Eigenschaften und Fähigkeiten von Natürlichen Killer-Zellen (NK-Zellen) eröffnen vielversprechende Möglichkeiten, die Komplikationen einer Stammzelltransplantation besser zu kontrollieren. Dafür ist es notwendig, NK-Zellen in möglichst reiner Form und ausreichender Menge bereitzustellen. Seit einigen Jahren stehen verschiedene immunomagnetische Antikörper zur Verfügung, mit denen Zellen gezielt selektiert oder depletiert werden können. Allerdings sind die Herstellerangaben zu Versuchsbedingungen an experimentellen Ansätzen orientiert. Um die Antikörper im klinischen Bereich in entsprechenden Größenordnungen einzusetzen, sind Versuchsansätze in klinischen Größenmaßstäben nötig. In dieser Arbeit wird eine Methode zur immunomagnetischen T-Zell-Depletion bei der Herstellung von NK-Zell-Präparaten untersucht. Mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern werden Zellen immunomagnetisch markiert und in einem starken Magnetfeld getrennt. Es wird ein etablierter Einzelantikörper („CD3 MicroBeads“) mit einem neuen Antikörper Kit („NK isolation kit“) verglichen. In der Versuchsreihe sollen die Wahl des Antikörpers, die Antikörpermenge, und die Flussgeschwindigkeit durchs Magnetfeld (Auftraggeschwindigkeit) hinsichtlich ihres Einflusses auf die T-Zell-Depletion, die T-Zell-Restkontamination nach Depletion und den NK-Zell-Ertrag untersucht werden. Bei einem der verwendeten Antikörper („NK isolation kit“) interessiert außerdem die NK-Zell-Reinheit des resultierenden NK-Zell-Präparates. Während die T-Zell-Depletion mit dem „NK isolation kit“ tendenziell größer ist als mit „CD3 MicroBeads“, unterscheiden sich beide Antikörper nicht signifikant in der T-Zell-Restkontamination. Mit „CD3 MicroBeads“ kann allerdings eine verlässlichere T-Zell-Restkontamination mit einer geringeren Schwankungsbreite der Ergebnisse erreicht werden. Weiterhin liefern „CD3 MicroBeads“ einen signifikant höheren NK-Zell-Ertrag, da mit dem „NK isolation kit“ abhängig von der eingesetzten Antikörpermenge und der damit zusammenhängenden Antikörperkonzentration mehr NK-Zellen in der magnetischen Trennsäule verloren gehen. Dabei deutet sich an, dass bei einer höheren Auftraggeschwindigkeit der NK-Zell-Verlust geringer ist. Die Menge der eingesetzten Antikörper korreliert beim „NK isolation kit“ positiv mit der erzielten NK-Zell-Reinheit. Die vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit einem Einzelantikörper („CD3 MicroBeads“) also auch mit einem Antikörper-Cocktail („NK isolation kit“) eine ausreichende Depletion von T-Zellen in einem klinischen Maßstab möglich ist. Bei beiden Verfahren kann mit einem Separationsschritt eine höhere T-Zell-Depletion erreicht werden, als mit anderen oder ähnlichen in der Literatur beschriebenen Verfahren. Während mit dem „NK isolation kit“ in einem Depletionsschritt NK-Zell-Präparate mit bis zu 90%iger Reinheit hergestellt werden können, müsste sich nach der T-Zell-Depletion mit „CD3 MicroBeads“ noch eine NK-Zell-Positivselektion anschließen. Während die Auftraggeschwindigkeit von untergeordneter Bedeutung ist, spielt die eingesetzte Antiköpermenge beim „NK isolation kit“ eine signifikante Rolle.
• Bone marrow transplantation or peripheral blood stem cell transplantation respectively is becoming increasingly important in the treatment of several diseases. Despite all the advances made, this form of therapy can cause complications that are difficult to manage. Thus its use is limited. The characteristics of natural killer cells offer promising means to control complications such as graft-versus-host-disease and host-versus-graft-disease. Because of this, it is necessary to ensure a sufficient quantity of NK cells is available, in the purest possible form. For many years now immunomagnetic antibodies have been available to selectively mark and separate cells. But manufacturer specifications are based on small scale experiments. Clinical scale studies are necessary before immunomagnetic antibodies are used in clinical applications. In this study, a method to immunomagnetically deplete T-cells was tested. By using magnetically labeled monoclonal antibodies, cells were marked and separated in a strong magnetic field. An established antibody, “CD3 MicroBeads”, was compared to a new antibody kit, “NK isolation kit”. Concerning the effect on T-cell-depletion, T-cell-contamination after depletion and NK-cell-recovery changes in the choice of antibody, the amount of antibody and flow rate were tested. When the “NK isolation kit” was used, the NK-cell-purity of the resulting NK-cell-specimen was also of interest. T-cell-depletion was slightly but not significantly higher with the “NK isolation kit” than with the “CD3 MicroBeads”. There were no significant differences in T-cell-contamination. But with “CD3 MicroBeads” a more reliable T-cell-contamination with variation over a smaller range was obtained. In addition “CD3 MicroBeads” yielded a higher NK-cell-recovery. Using the “NK isolation kit”, a higher percentage of NK-cells was lost within the depletion column, depending on the amount of antibodies used and the corresponding higher antibody concentration. There are indications that a higher flow rate reduces the loss of NK-cells. The amount of antibodies correlates positively with NK-cell-purity. The results show that both “CD3 MicroBeads” and “NK isolation kit” are capable of sufficiently depleting T-cells in a clinical scale setting. Only one depletion-cycle was necessary to achieve a higher T-cell-depletion than mentioned elsewhere in literature. With “NK isolation kit”, one depletion cycle was sufficient to yield a NK-cell-specimen with a purity as high as 90%. “CD3 MicroBeads” would need another cycle of NK-cell-selection after T-cell-depletion. While the flow rate has minor importance, the amount of antibody when using the “NK isolation kit” plays a significant role.