Investigation of coupled electron and proton transfer in the quinol : fumarate reductase from Wolinella succinogenes with electrochemically induced FTIR and VIS difference spectroscopy and multiconformation continuum electrostatic calculations

  • The enzyme quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic e-proteobacterium Wolinella succinogenes is part of the anaerobic respiratory system of this organism. It couples the reduction of fumarate to succinate to the oxidation of menaquinol to menaquinone. W. succinogenes uses fumarate as terminal electron acceptor and can use various substrates (e.g., formate or molecular hydrogen) as electron donors. The concerted catalytic substrate turnover of either a hydrogenase or a formate dehydrogenase in conjunction with QFR contributes to the generation of an electrochemical potential gradient across the bacterial plasma membrane, which is used for the phosphorylation of ADP with inorganic phosphate, Pi, to ATP. In addition to an FAD (in subunit A) and three iron-sulfur clusters (in subunit B), QFR binds a low- and a high-potential heme b group in its transmembrane subunit C, as was ultimately shown in the crystal structure at 2.2 Å resolution (Lancaster et al., 1999, Nature 402, 377– 385). Both hemes are part of the electron transport chain between the two catalytic sites of this redox enzyme. The midpoint potentials of the hemes are well established but their assignment to the distal and proximal positions in the structure had not yet been determined. Furthermore, QFR from W. succinogenes has been proposed to exhibit a novel coupling mechanism of transmembrane electron and proton transfer, which has been described in the so-called “E-pathway” hypothesis (Lancaster, 2002, Biochim. Biophys. Acta 1565, 215–231). The aim of this project was to characterize the relationship between structure and function of QFR and to investigate the details of the proposed coupling mechanism (“Epathway”) with the help of computer-based electrostatic calculations on the QFR wild-type (WT) coordinates, and electrochemically induced FTIR and VIS difference spectroscopy on the QFR WT and available variant enzymes (in particular enzyme variant E180Q, in which the glutamic acid at position C180 has been replaced by a glutamine). 1.) It was demonstrated in this study that the diheme-containing QFR exhibits stable and reproducible electrochemically induced FTIR difference bands in the midinfrared range from 1800 cm-1 to 1000 cm-1 that reflect transitions from the reduced to the oxidized state of the enzyme. The spectral features that were observed in the FTIR difference spectra are fully reversible when changing from a reductive to an oxidative reference potential at the working electrode and vice versa. This indicates that the underlying redox reactions of the enzyme at the gold grid working electrode are also fully reversible under the applied experimental conditions. The same reversible spectral redox behavior in the visible range could also be ascertained for the Soret- and a-band of the two heme b groups of QFR. This behavior allowed to reliably determine the heme b midpoint potentials of QFR at various pH values. Analysis of the FTIR difference spectra in the amide I range yields evidence for structural reorganizations of the polypeptide backbone upon the electrochemically induced redox reaction. 2.) The redox titrations of the high- and low-potential heme b of QFR as simulated by multiconformation continuum electrostatics (MCCE) calculations showed a very high level of agreement with respect to the experimentally observed midpoint potentials of the heme b groups at pH 7. As determined with the help of the theoretical calculations, prominent features governing the differences in redox potential between the two hemes are the higher loss of reaction field energy for the proximal heme and the stronger destabilization of the oxidized form of the proximal heme due to several buried and ionized Arg and Lys residues. The explicit incorporation of crystallographically identified water molecules in the calculations had a noticeable effect on the absolute values of the determined midpoint potentials, although the relative difference of the two obtained midpoints did not change significantly. The results of the electrostatic calculations clearly showed that the lowpotential heme corresponds to the distal position bD in the structure, and that the high-potential heme is identical to the proximal heme bP. This assignment could previously not be achieved unequivocally with experimental methods. 3.) In addition, the currently discussed mechanism of coupled electron and proton transfer in the QFR of W. succinogenes (i.e., the “E-pathway” hypothesis) is further supported by the results of this study. The simulations of intermediate states of electron transfer via the heme b groups show that the protonation state of the key amino acid residue Glu C180 depends on the redox states of the heme groups as suggested in the “E-pathway” hypothesis. This result yields a possible mechanism for the coupling of transient transmembrane proton transfer via Glu C180 to the electron transfer via the heme b groups, since Glu C180 could be part of a “proton wire” and its redox-dependent protonation state could serve as the regulatory element of the “E-pathway”. Furthermore, the results of simulated heme reduction indicate that the side chain of Glu C180 also changes its conformation with respect to the redox state of the hemes. Both major results concerning the role of Glu C180, the change of protonation as well as the reorientation of the side chain upon reduction of the heme groups, are consistent with the results from electrochemically induced FTIR difference spectroscopy: Of particular interest was the spectral range above 1710 cm-1, where C=O stretching vibrations of protonated COOH carboxyl groups absorb, because those groups can act as proton donors, respectively acceptors, and can be involved in intra-protein proton transfer reactions. It was possible to observe signals of such protonated carboxyl groups originating from QFR enzyme, which either change their protonation state and/or experience an environmental change in the course of the induced redox reaction. This finding was supported by the fact that the relevant FTIR difference signals are sensitive to an isotopic hydrogen/deuterium (1H/2H) exchange via the buffer solution, since they were shifted towards lower wavenumbers in D2O. Furthermore, it could be shown with the help of site-directed mutagenesis that the acidic residue Glu C180, which is located in the membranespanning, diheme-containing subunit C of QFR, is contributing to the redox dependent signal of protonated carboxyl groups. The observed residual signal in the FTIR double-difference spectrum of QFR wild-type and enzyme variant E180Q (Glu C180 has been replaced with a Gln residue) could be interpreted as a protonation/deprotonation event that is superimposed by an environmental effect on the specific C=O vibration. This result strongly supports the proposed “E-pathway” of coupled transmembrane electron and proton transfer in the QFR enzyme, which states that residue Glu C180 is an essential constituent of a transient redox-controlled transmembrane proton transfer pathway. 4.) As a second possible constituent of the suggested “E-pathway”, the ring C propionate of the distal heme was found to be unusually fully protonated in all simulated redox states, indicating a possible role as a transient proton donor/acceptor in the “E-pathway”. Similarly to Glu C180, experimental evidence from FTIR difference spectroscopy on a modified QFR with 13C-labeled heme propionates was obtained, which indicates an involvement of at least one of the two propionates of heme bD in proton transfer. The observed signals can tentatively be interpreted as a redox-coupled (de)protonation of the ring C propionate of bD, which is possibly xiii superimposed by a conformational or environmental change of the specific propionate. 5.) Also the observation of a strong redox Bohr effect for both heme b groups in QFR is in line with the proposed “E-pathway” hypothesis, as this effect yields a possible and well-established mechanism for the coupling of proton transfer and redox changes of the heme groups. The comparison of the observed effect in QFR WT and E180Q together with the results from FTIR spectroscopy and MCCE calculation indicate that the ring C propionate of the distal heme is dominating the pHdependence of the midpoint potential of bD, and that the corresponding group for bP is Glu C180. The origin of the redox Bohr effect for bP in the enzyme variant E180Q (which is dramatically changed with respect to the WT) could not be identified unequivocally, but the observation of this redox Bohr effect in the variant implies the presence of other protolytic groups, which interact with heme bP and which may be necessary for a functional “E-pathway”.
  • Das Enzym Chinol:Fumarat-Reduktase (QFR) des anaeroben e-Proteobakteriums Wolinella succinogenes ist Teil der anaeroben Atmungskette dieses Organismus. QFR koppelt die Reduktion von Fumarat zu Succinat an die Oxidation von Menachinol zu Menachinon. In W. succinogenes ist Fumarat der terminale Elektronenakzeptor, und der Organismus verwendet z. B. die Substrate Formiat oder molekularen Wasserstoff als Elektronendonor. Der gemeinsame katalytische Substratumsatz der QFR zusammen mit entweder der Hydrogenase oder der Formiat-Dehydrogenase trägt zum Aufbau eines elektrochemischen Protonenpotentials über die bakterielle Cytoplasmamembran bei. Dieses Potential wird von der ATP-Synthase zur Phosphorylierung von ADP mit anorganischem Phosphat (Pi) zu ATP benützt. Zusätzlich zu einem kovalent gebundenen FAD in der A-Untereinheit des Enzyms und drei Eisen-Schwefelzentren in der B-Untereinheit bindet QFR ein Niedrig- und ein Hochpotential-Häm, wie abschließend in der röntgenkristallographisch ermittelten dreidimensionalen Proteinstruktur bei einer Auflösung von 2.2 Å gezeigt werden konnte (Lancaster et al., 1999, Nature 402, 377–385). Beide Häme sind offenbar Teil der Elektronentransportkette zwischen den beiden katalytischen Zentren dieses Redox-Enzyms. Die Mittelpunktspotentiale der beiden Hämgruppen sind bekannt, ihre Zuordnung zur distalen und proximalen Position im Enzym jedoch nicht. Des weiteren wurde für die QFR von W. succinogenes ein neuartiger Mechanismus der Kopplung von transmembranen Elektronen- und Protonentransfer, die sogenannte „E-Weg“ Hypothese (Lancaster, 2002, Biochim. Biophys. Acta 1565, 215–231), vorgeschlagen. Das Ziel dieser Arbeit war die genauere Charakterisierung der mechanistischen Beziehung zwischen Struktur und Funktion der QFR, und die detaillierte Untersuchung des vorgeschlagenen Kopplungsmechanismus (der „E-Weg“ Hypothese) mit Hilfe von rechnergestützten elektrostatischen Rechnungen auf Grundlage der röntgenkristallographischen Strukturkoordinaten sowie mit Hilfe von elektrochemisch induzierter FTIR- und VIS-Differenzspektroskopie am QFR Wild-Typ und an verschiedenen zur Verfügung stehenden Enzymvarianten (insbesondere der Variante E180Q, in welcher der entsprechende Rest Glu C180 durch ein Glutamin ersetzt wurde). 1.) Im Verlaufe dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die di-hämhaltige QFR stabile und reproduzierbare elektrochemisch induzierte FTIR-Differenzbanden im mittleren infraroten Spektralbereich zwischen 1800 und 1000 Wellenzahlen (cm-1) aufweist, welche Übergänge des Enzyms zwischen dem oxidierten und reduzierten Zustand der QFR widerspiegeln. Die spektralen Signaturen, die in den Differenzspektren beobachtet wurden, sind vollständig reversibel, wenn das oxidierende und das reduzierende Referenzpotential an der Arbeitselektrode vertauscht werden. Dieses Verhalten weist darauf hin, daß die zugrundeliegenden Redox-Reaktionen des Enzyms an der Gold-Arbeitselektrode unter den verwendeten experimentellen Bedingungen ebenfalls vollständig reversibel sind. Dasselbe reversible spektrale Verhalten wurde auch für die Redox-Abhängigkeit der Soret- und der a-Bande der Häm b Gruppen im sichtbaren Spektralbereich festgestellt. Dies wiederum erlaubte die zuverlässige Bestimmung der Mittelpunktspotentiale der Häm b Gruppen der QFR bei verschiedenen pH-Werten. Die Analyse der FTIR-Differenzspektren im Bereich der spektralen Beiträge der Amid I Schwingungen weist auf eine strukturelle Umordnung des Polypeptidrückgrats infolge der elektrochemisch induzierten Redox-Reaktion hin. 2.) Die mit Hilfe der multikonformations-kontinuums-elektrostatischen (MCCE) Rechnungen simulierten Redox-Titrationen an den Hoch- und Niedrigpotential- Hämen der QFR wiesen eine sehr gute Übereinstimmung mit den experimentell ermittelten Werten für die Häm b Mittelpunktspotentiale bei pH 7 auf. Die wesentlichen energetischen Beiträge, die mit Hilfe der theoretischen Rechnungen für die unterschiedlichen Mittelpunktspotentiale der beiden Häm b Gruppen bestimmt werden konnten, sind ein größerer Verlust an sogenannter „Born“ Energie (diese beschreibt den Verlust an Solvatationsenergie, wenn die relevante chemische Gruppe aus einer hydrophilen löslichen Umgebung in das hydrophobe Innere des Proteins übertragen wird) des proximalen Häms und eine stärkere Destabilisierung des oxidierten Zustands des proximalen Häms aufgrund von mehreren ionisierten Arg und Lys Aminosäureseitenketten. Die explizite Berücksichtigung von röntgenkristallographisch identifizierten Wassermolekülen hatte einen merklichen Effekt auf die absoluten Werte der rechnerisch bestimmten Mittelpunktspotentiale der beiden Häme, obwohl sich deren Differenz relativ gesehen kaum veränderte. Die Ergebnisse der elektrostatischen Rechnungen ließen eine eindeutige Zuordnung des Niedrigpotential-Häms zur distalen Position bD und des Hochpotential-Häms zur proximalen Position bP in der Struktur der QFR zu. Diese Zuordnung war mit experimentellen Methoden bisher nicht eindeutig möglich. 3.) Der aktuell diskutierte Mechanismus des gekoppelten Elektronen- und Protonentransfers in der QFR (die „E-Weg“ Hypothese) erfährt weitere Unterstützung durch die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse. Die Simulationen von intermediären Elektronentransferzuständen in Bezug auf die beiden Häm b Gruppen zeigen, daß der Protonierungszustand von Glu C180 von der Oxidationsstufe der Häm-Gruppen abhängt, wie es im Rahmen der „E-Weg“ Hypothese vorgeschlagen wurde. Dieses Ergebnis liefert daher einen denkbaren Mechanismus für die Kopplung von transientem transmembranen Protonentransfer an die Elektronenübertragung über die Häm-Gruppen, da es eine Rolle von Glu C180 als essentielles Glied einer Protonentransferkette, und somit auch als ein regulatorisches Element des „E-Weges“, stützt. Zusätzlich deuten die Ergebnisse der simulierten Häm-Reduktion darauf hin, daß die Seitenkette von Glu C180 auch eine Konformationsänderung in Abhängigkeit des Redox-Zustandes der Häme erfährt. Die beiden wesentlichen Ergebnisse die Rolle des Aminosäurerestes Glu C180 betreffend, d.h. die Protonierungsänderung sowie die Reorientierung der Seitenkette, stehen in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der elektrochemisch induzierten FTIR-Differenzspektroskopie. Von besonderem Interesse war der Spektralbereich oberhalb von 1710 Wellenzahlen (cm-1), in dem die C=O Streckschwingungen von protonierten COOH Carboxylgruppen absorbieren, da diese Gruppen als Protonendonor bzw. –akzeptor agieren und somit an Protonentransferprozessen innerhalb des Proteins beteiligt sein können. Es war möglich, Signale solcher protonierten Carboxylgruppen zu beobachten, die eindeutig dem QFR-Enzym zuzuordnen waren. Diese Signale zeigen, daß die betroffenen Gruppen entweder ihren Protonierungsgrad ändern und/oder eine Umgebungsänderung im Verlauf der induzierten Redox-Reaktion erfahren. Diese Beobachtung wurde von der Tatsache gestützt, daß die entsprechenden FTIR-Differenzsignale sensitiv gegenüber einem Isotopenaustausch von Wasserstoff zu Deuterium (1H/2H) sind und in D2O zu niedrigeren Wellenzahlen hin verschoben waren. Weiterhin konnte mit Hilfe von gerichteter Mutagenese gezeigt werden, daß der saure Aminosäurerest Glu C180, welcher sich in der transmembranen, hämhaltigen C-Untereinheit der QFR befindet, zum redox-abhängigen Signal der protonierten Carboxylgruppen beiträgt. Die beobachtete Bande im FTIR-Doppeldifferenzspektrum, gebildet aus dem Wild-Typ der QFR und der Enzymvariante E180Q, kann als Protonierungsänderung von Glu C180 interpretiert werden, welche von einer Umgebungsänderung der entsprechenden C=O Schwingung überlagert wird. Dieses Ergebnis stellt eine weitere deutliche Untermauerung der „E-Weg“ Hypothese des gekoppelten transmembranen Elektronen- und Protonentransfers im Enzym QFR dar, welche besagt, daß Glu C180 ein essentieller Bestandteil eines transienten, redox-kontrollierten transmembranen Protonentransferweges ist. 4.) Als zweiter möglicher Bestandteil des vorgeschlagenen „E-Weges“ könnte das Ring C Propionat des distalen Häms in Frage kommen, welches in ungewöhnlicher Weise in allen modellierten Redox-Zuständen als vollständig protoniert berechnet wurde. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, daß diesem Propionat eine mögliche Rolle als transienten Protonendonor bzw. –akzeptor im Rahmen des diskutierten „E-Weges“ zukommen könnte. Ähnlich wie für Glu C180 wurde auch in diesem Fall mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie an einer Variante der QFR, in welcher speziell die Carboxylkohlenstoffatome der Hämpropionate mit dem Kohlenstoffisotop 13C markiert waren, Ergebnisse gewonnen, die auf eine Beteiligung mindestens eines der beiden Propionate des distalen Häms bD am vorhergesagten Protonentransfer hindeuten. Die beobachteten Signale werden vorläufig derart interpretiert, daß das Ring C Propionat des Häms bD eine redoxgekoppelte Protonierungsänderung erfährt, welche möglicherweise von einer Umgebungsänderung des selben Propionats überlagert wird. 5.) Auch der Nachweis eines ausgeprägten Redox-Bohr Effektes für beide Hämgruppen der QFR steht im Einklang mit der vorgeschlagenen „E-Weg“ Hypothese, da dieser Effekt einen möglichen und gut studierten Mechanismus darstellt, wie Protonentransfer an Änderungen der Oxidationsstufe von Häm- Gruppen gekoppelt sein kann. Vergleicht man den beobachteten Effekt im QFR Wild-Typ und in der Variante E180Q und stellt dieses Ergebnis in Zusammenhang mit den anderen Resultaten der FTIR-Spektroskopie und der elektrostatischen Rechnungen, so kommt man zu dem Schluß, daß das Ring C Propionat des distalen Häms die dominierende protolytische Gruppe für die pH-Abhängigkeit des Mittelpunktspotentials von Häm bD zu sein scheint, und daß Glu C180 die entsprechende Gruppe in bezug auf das Häm bP darstellt. Der genaue Ursprung des (im Vergleich zum Wild-Typ sehr deutlich geänderten) Redox-Bohr Effekts für das Häm bP in der Enzymvariante E180Q konnte nicht eindeutig identifiziert werden. Die Beobachtung dieses Redox-Bohr Effekts in der Variante deutet auf den Einfluß anderer protolytischer Gruppen hin, welche mit Häm bP in Wechselwirkung stehen, und die möglicherweise ebenfalls notwendig sein könnten für einen funktionellen „E-Weg“.

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Author:Alexander H. Haas
Referee:Werner Mäntele
Document Type:Doctoral Thesis
Date of Publication (online):2005/03/15
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2004/09/02
Release Date:2005/03/15
Institutes:Physik / Physik
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 53 Physik / 530 Physik
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht