Konformationelle Vielfalt : Synthese eines spleißosomalen RNA-Konstruktes, NMR-Strukturen von Minigramicidin und einem molekularen Schalter

The variety of conformations : synthesis of a spliceosomal RNA construct, NMR structures of minigramicidin and a molecular switch

  • Erfolgreich wurde die biochemische Synthese eines Kernbereiches der spleißosomalen U4/U6-RNA etabliert und die Sekundärstruktur mittels NMR-spektroskopischer Methoden charakterisiert. Die Konformationen von zwei molekularen Regeleinheiten, des auf Gramicidin A basierenden Ionenkanals Minigramicidin sowie einem aus zwei cis-Dekalinen aufgebautenmolekularen Schalters konnten in unterschiedlichen Umgebungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie erfolgreich bestimmt werden. Die Synthese des RNA-Konstruktes u4u6a46phh2 erfolgte durch Transkription von plasmidischer Templat-DNA mit T7-Polymerase und anschließender Aufreinigung mittels Gelelektrophorese und Homogenisierung am 3’-Ende mit Hilfe eines passenden Hammerhead-Ribozyms. u4u6a46phh2-RNA kann als Konstrukt für die Synthese von 13C/15N-gelabelter RNA dienen, da die Schneidreaktion und die daraus resultierende RNA definiert ist und die Integrale der Iminoprotonen für eine einzige Konformation der RNA sprechen. Das von Dr. Hans-Dieter Arndt in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Koert an der Humboldt-Universität zu Berlin hergestellte Minigramicidin ist aus zwei verkürzten Gramicidin A-Einheiten aufgebaut, die in einer Kopf-an-Kopf Anordnung durch einen Bernsteinsäure-Linker kovalent verknüpft sind. In dieser Arbeit wurden die Strukturen von Minigramicidin in zwei unterschiedlichen Umgebungen aufgeklärt: in Benzol/Aceton (10:1, v/v) ohne Zusatz von Kationen und in gesättigter Cäsiumchlorid-Chloroform/Methanol (3:1, v/v)-Lösung. Im ersten Fall findet man ein doppelt helikales linksgängiges Dimer von Minigramicidin mit ca. 5.7 Resten pro Windung. Diese Struktur hat eine Länge von ca. 38 Å und einen Durchmesser von ca. 1.2 Å. Mit Cäsium-Kationen liegt die Verbindung als Monomer vor. Sie bildet eine rechtsgängige pi-Helix mit ca. 6.3 Resten pro Windung. Die Struktur hat eine Länge von 17 Å und einen Durchmesser von ca. 4.5 Å. Es konnte erstmals eine zur ionenkanalaktiven Form des gA ähnliche Konformation eines auf gA basierenden künstlichen Ionenkanals in organischen Lösemitteln nachgewiesen werden. Der von Dr. Michael Karle aus der Arbeitsgruppe von Prof. Koert an der Philipps-Universität Marburg synthetisierte molekulare Schalter besteht aus zwei cis-Dekalineinheiten, die durch einen 14-gliedrigen Bislactam-Ring miteinander gekoppelt sind. Der Schaltprozeß wurde dabei durch die saure Spaltung des Ley-Acetals in 13 ausgelöst. Es wurde für die Verbindung 13 eine all-axial Stellung für den Makrozyklus gefunden. Diese Struktur wird auch durch die gefundenen Kopplungskonstanten gestützt. Nach dem Schaltprozeß wurde die Struktur von 16 ermittelt. Wie erwartet, wurde durch das Lösen der konformativen Klammer ein Doppelringflip im linken Dekalingerüst ausgelöst und durch den Makrozyklus auf das rechte Dekalingerüst übertragen. Die gefundenen ROE-Abstände und Kopplungskonstanten für bestimmte Dekalinprotonen bestätigen die umgeschaltete Struktur.
  • The succesful synthesis of the core region of the spliceosomal U4/U6-RNA by biochemical synthesis with T7 polymerase is described. The u4u6a46phh1 RNA construct was characterized by homonuclear NMR spectroscopy. The three dimensional structure of an artificial ion channel, minigramicidin, was determined by homonuclear NMR spectroscopy. Minigramicidin shows in benzene/acetone (10:1, v/v) a left-handed, intertwined double helix dimer with a length of about 38 Å and a diameter of about 1.2 Å In chloroform/methanol (3:1, v/v) saturated with CsCl, minigramicidin forms a right-handed helical monomer with a length of 17 Å and a diameter of about 4.5 Å. The two conformations of an artificial molecular switch before and after a chemical induced switching event is characterized by homonuclear NMR experiments and molecular dynamics simulations. The switch consists of two coupled cis-decalin units. The switching event caused a double ring flip in the left decalin unit and passed througt the macro cylcus to the right decalin unit.

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Metadaten
Author:Dirk Bockelmann
URN:urn:nbn:de:hebis:30-29829
Referee:Christian Griesinger
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2006/07/14
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/07/05
Release Date:2006/07/14
Tag:Dekalin; Minigramicidin; Molekularer Schalter; U4/U6
Decalin; Minigramicidin; U4/U6; molecular switch
GND Keyword:NMR-Spektroskopie; Gramicidin A; Ionenkanal; RNS-Synthese; Konformationsanalyse; Peptide
HeBIS-PPN:179531727
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht