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Tobias Noeske

• The goal of this thesis was to gain further insight into the binding behavior of ligands in the heptahelical domain (HD) of group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs). This was realized by the establishment of strategies for the detection and optimization of molecules acting as non-competitive antagonists of group I mGluRs (mGluR1/5). These strategies should guarantee high diversity in the retrieved chemotypes of the detected compounds not resembling original reference molecules (“scaffold-hopping”). The detection of new scaffolds, in turn, was divided into two approaches: First the development of pharmacological assays to screen compounds at a certain target for bioactivity (here: affinity towards the allosteric recognition site of mGluR1 and mGluR5), and second the evaluation of computer assisted methods for the identification of virtual hits to be screened afterwards on the pharmacological assays established before. Promising molecules should be optimized with respect to activity/affinity and selectivity, their binding mode investigated and, finally, compared to existing lead compounds. Initially, membrane based binding assays for the HD of mGlu1 and mGlu5 receptors with enhanced throughput (shifting from 24-well plates to 96-well plates) were set up. For the mGluR1 assay the potent antagonist EMQMCM exhibited high affinity towards the binding site (Ki ~3nM), which is in accordance with published data from Mabire et al. (functional IC50 3nM). For mGluR5 the reference antagonist MPEP binds with high affinity to the receptor (binding IC50 13.8nM), which confirmed earlier findings from Anderson et al. (binding IC50 15nM). In another series of experiments the properties of rat cerebellar (mGluR1) and corticalmembranes (mGluR5) as well as of radiotracers were investigated by means of binding saturation studies and kinetic experiments. Furthermore, the influence of the solvent DMSO, necessary for compound screening of lipophilic substances, on positive and negative controls was evaluated. As the precise architecture of the HD of mGluR1 is still not known our efforts in identifying new ligands for this receptor focused on the ligand-based approach. All computer assisted methods that were applied to virtually screen large compound collections and to retrieve potential hits (“activity-enriched subsets”) acting at the heptahelical domain of mGluR1 relied on the existence of a valid dataset of reference molecules. This was realized by an initial compilation of a mGluR reference data collection comprising in total 357 entries predominantly negative but also some positive allosteric modulators for mGluR1 and mGluR5. In the next step a pharmacophore model for non-competitive mGluR1 antagonists was constructed. It was based upon six selective, potent and structurally diverse ligands. Prospective virtual screening was performed using the CATS atom-pair descriptor. The Asinex Gold-Collection was screened for each seed compound and some of the most similar compounds (according to the CATS descriptor) were ordered and tested forbinding affinity and functional activity at mGluR1. A high hit rate of approximately 26% (IC50 < 15 micro M) was yielded confirming the applicability of this method. One compound exerted functional activity below one micro molar (IC50-value of C-07:362nM ± 0.03). Moreover, non-linear principal component analysis was employed. Again the Asinex vendor database served as test database and was filtered by the pharmacophore model for mGluR1 established before. Test molecules that were adjacently located with mGluR1 antagonist references were selected. 15 compounds were tested on mGluR1 in binding and functional assays and three of them exhibited functional activity (IC50) below 15 micro M. The most potent molecule P-06 revealed an IC50-value of 1.11 micro M (± 0.41). The COBRA database comprising 5,376 structurally diverse bioactive molecules affecting various targets was encoded with the CATS descriptor and used for training two selforganizing maps (SOM). The encoded mGluR reference data collection was projected onto this map according to the SOM algorithm. This projection allowed to clearly distinguish between antagonists of mGluR1 and mGluR5 subtype. 28 compounds were ordered and tested on activity and affinity for mGluR1. They exhibited functional activity down to the sub-micro molar range (IC50-value of S-08: 744nM ± 0.29) yielding a final hit rate of 46% (<15 micro M). Then, the Asinex collection was screened using the SOM approach. For a predicted target panel including the muscarinic mACh (M1) receptor, the histamine H1-receptor and the dopamine D2/D3 receptors, the tested mGluR ligands exhibited the calculated binding pattern. This virtual screening concept might provide a basis for early recognition of potential sideeffects in lead discovery. We superimposed a set of 39 quinoline derivatives as non-competitive mGluR1 antagonists that were recently published by Mabire and co-workers. A CoMFA model (QSAR) was established and the influence of several side chains on functional activity was investigated. The coumarine derivative C-07 was obtained as a result of similarity searching. Starting from this compound a series of chemical derivatives was synthesized. This led to the discovery of potent (B-28, IC50: 58nM ± 0.008; Ki: 293nM ± 0.022) and selective (rmGluR5 IC50: 28.6 micro M) mGluR1 antagonists. From a homology model of mGluR1 we derived a potential binding mode for coumarines within the allosteric transmembrane region. Potential interacting patterns with amino acids were proposed considering the difference of the binding pockets between rat and human receptors. The proposed binding modes for quinolines (here:EMQMCM) and coumarines (here:B-04) were compared and discussed considering in particular the influence on activity of several side chains of quinolines obtained from the QSAR studies. The present studies demonstrated the applicability of ligand-based virtual screening for non-competitive antagonists of a G-protein coupled receptor, resulting in novel, potent and selective agents.
• Ziel dieser Doktorarbeit war es weiteren Einblick in das Bindungsverhalten von Liganden in der transmembranen Region von Gruppe I metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRs) zu gewinnen. Verwirklicht wurde dies durch den Entwurf von Strategien zur Auffindung und Optimierung von Molekülen die als nichtkompetitive Antagonisten an Gruppe I mGluRs (mGluR1/5) wirken. Diese Strategien sollten eine hohe Diversität der chemischen Strukturen der entdeckten Verbindungen gewährleisten und nicht den ursprünglichen Referenzmolekülen ähneln (das sogenannte „Grundgerüst-Springen“). Die Auffindung neuer Kernstrukturen wiederum wurde in zwei Herangehensweisen aufgeteilt: Zum einen die Entwicklung von pharmakologischen Tests um Substanzen auf Bioaktivität an einer bestimmten Zielstruktur zu untersuchen (hier: die Affinität zur allosterischen Bindungsstelle von mGluR1 und mGluR5), und zum anderen die Evaluierung von computergestützten Methoden für die Identifizierung von virtuellen Suchtreffern die dann in den zuvor etablierten pharmakologischen Testsystemen untersucht werden können. Basierend auf den hierin gemachten Ergebnissen sollten vielversprechende Moleküle bezüglich Aktivität, Affinität und Selektivität optimiert werden, ihr Bindungsmodus untersucht und schließlich mit dem von bereits bekannten Leitstrukturen verglichen werden. Anfangs wurden membranbasierte Bindungstests für die transmembrane Region von mGluR1 und mGluR5 mit erhöhtem Durchsatz entworfen (Transfer vom 24-Lochplatten- auf 96-Lochplattenformat). In diesem Zusammenhang wurde das bereits vorhandene Wissen über einen zur Verfügung stehenden NMDA-Rezeptor-Bindungstest genutzt. Hierbei wurde der Einfluss verschiedener Parameter wie Proteinkonzentration, Inkubationszeit, Inkubationstemperatur, etc. erforscht. Validiert wurden die Testsysteme mit Affinitätsmessungen für Standardverbindungen: Für den mGluR1 Bindungsversuch zeigte der potente Antagonist EMQMCM hohe Affinität an der Bindungsstelle (Ki ~3nM), was in Übereinstimmung mit publizierten Daten von Mabire et al. steht (funtioneller IC50 3nM). Für mGluR5 zeigte der Referenz-Antagonist MPEP hohe Affinität am Rezeptor (Bindungs IC50 13,8nM) was durch frühere Untersuchungen von Anderson et al. bestätigt wird (Bindungs IC50 15nM). In einer weiteren Experimentreihe wurden die Eigenschaften von Cerebellum- Membranen (mGluR1) und Cortex-Membranen (mGluR5) der Ratte untersucht sowie die Eigenschaften eines Radioliganden, und zwar in Form von Bindungs-Sättigungsversuchen und Kinetik-Experimenten. Desweiteren wurde der Einfluss des Lösungsmittels DMSO, das für das Lösen lipophiler Substanzen notwendig war, auf Positiv- und Negativkontrolle geprüft. Da die exakte Kristallstruktur der transmembranen Region von mGluR1 noch immer unbekannt ist haben sich unsere Anstrengungen zur Identifizierung neuer Liganden für diesen Rezeptor auf den ligandenbasierten Ansatz beschränkt. Alle computergestützten Methoden die für das virtuelle Durchforsten großer Substanzdatenbanken zur Auffindung potentieller Treffer angewandt wurden (sogenannter „aktivitätsangereicherte Untergruppen“) basieren auf der Existenz eines validen Datensatzes von Referenzmolekülen. Verwirklicht wurde dies zu Beginn durch das Zusammenstellen einer mGluR Referenzdatenbank mit 357 Einträgen, vornehmlich negative aber auch einige positive Modulatoren an mGluR1 und mGluR5. Anhand umfangreicher Suche in sachbezogener Literatur (Patente und Veröffentlichungen) wurden Angaben gesammelt. Im nächsten Schritt wurde ein Phramakophormodell für nichtkompetitive mGluR1 Antagonisten erstellt. Es basiert auf einigen potenten, selektiven und strukturell diversen Liganden aus der mGluR Referenzdatenbank. Die Entwicklung eines aussagekräftigen Pharmakophormodells stellte einen wichtigen Schritt dar und war Grundlage für folgende Struktursuchen. Die dem Modell zu Grunde liegenden Moleküle wiederum dienten als Referenzmoleküle für eine auf einem topologischen Pharmakophordeskriptor basierende Ähnnlichkeitssuche: Prospektive virtuelle Suche wurde unter Benutzung des CATS Atompaar-Deskriptors durchgeführt, einer konformationsfreien Korrelationsvektorrepräsentation. Eine große Datenbank kommerziell erhältlicher Moleküle (Asinex Gold Collection: ~ 200.000 Einträge) wurde für jede Referenzstruktur durchsucht und einige derentsprechend dem CATS Deskriptor als am ähnlichsten erachteten Verbindungen wurden bestellt und auf Aktivität und Affinität an mGluR1 untersucht. Eine Trefferrate von ungefähr 26% (IC50 < 15 mikro M) die den Nutzen dieser Methode bestätigte, wurde erzielt. Darüber hinaus wies eine Verbindung submikromolare funktionelle Aktivität auf (IC50-Wert von C-07:362nM ± 31). Da dieses Cumarin auch eine vielversprechende Kernstruktur aufwies, wurde es direkt einer Leitstrukturoptimierung unterzogen. In einer weiteren Studie wurden die Vorteile von Pharmakophorsuche und Datenreduktion anhand nichtlinearer Hauptkomponentenanalyse kombiniert. Wiederum diente die Asinex Kollektion als Testdatenbank und wurde mit dem zuvor erstellten mGluR1 Pharmakophormodell gefiltert. Die resultierende „fokussierte Datenbank“ enthielt 2211 Einträge und wurde zusammen mit der mGluR Referenzdatenbank mit einer Vielzahl von 2D-Deskriptoren kodiert und anhand von ChemSpaceShuttle in einen dreidimensionalen Raum projiziert. Testverbindungen die in räumlicher Nachbarschaft zu mGluR1 Referenzen zu finden waren wurden ausgewählt. Einige von ihnen wurden bestellt und auf ihre gewünschte Bioaktivität hin untersucht. Insgesamt wurden fünfzehn Verbindungen in funktionellen Tests und Bindungstest für mGluR1 gemessen wobei drei von ihnen funktionelle Aktivität unter 15 mikro M aufwiesen. Die potenteste Verbindung P-06 zeigte einen IC50-Wert von 1,11 mikro M (± 0,41). Kohonen-Karten stellen eine Alternative zu Ähnlichkeitssuchen im Bereich der virtuellen Suche dar. Sie gruppieren Moleküle indem sie ähnliche Datenwerte zusammenstellen. In der vorliegenden Studie wurde die COBRA 3.12 Datenbank, die 5.376 strukturell unterschiedliche bioaktive Moleküle enthält die mit verschiedenen Rezeptoren und Enzymen wechselwirken, mit dem CATS Deskriptor verschlüsselt. Dann wurden zwei selbstorganisierende Karten (SOM) damit trainiert, eine mit 100 Neuronen und eine mit 225 Neuronen. Anschließend wurde die kodierte mGluR Referenzdatenbank gemäß dem SOM Algorithmus auf diese Karten projiziert. Diese Projektion erlaubte eine klare Trennung zwischen Antagonisten vom Subtyp mGluR1 und mGluR5. Ermutigt durch diese Ergebnisse wurde die Untergruppe der mGluR1 Referenzverbindungen auf die mit der COBRA Datenbank trainierten Karten projiziert und diejenigen Neurone die die höchste Dichte an Referenzverbindungen aufwiesen ausgewählt (Neuron 8/7 auf der kleinen Karte und 6/6 auf der großen Karte). In diesem Sinne wurde auch mit der Asinex Datenbank verfahren und alle Verbindungen die sich in beiden der eben erwähnten Neurone gruppiert haben wurden entsprechend ihrer räumlichen Entfernung zum Zentroid des jeweiligen Neurons sortiert. 28 der ersten 60 Molekülstrukuren wurden bestellt und auf Affinität und Aktivität an mGluR1 getestet. Sie wiesen (inhibitorische) Aktivitäten bis in den submikromolaren Bereich auf (IC50-Wert von S-08: 744nM ± 290) und führten zu einer Trefferquote von 46% (<15 mikro M). Die Anwendung der hier beschriebenen virtuellen Suchmethoden gewährte uns eine Auswahl von selektiven mGluR1 Antagonisten mit neuen Kernstrukturen. Im folgenden wurde ihr Bindungsmodus im Verhältnis zu dem der Referenzverbindungen untersucht und eine vielversprechende Verbindung, ein Cumarin-Derivat das durch die Ähnlichkeitssuche gefunden worden ist, wurde strukturell optimiert. Quantitative Struktur-Wirkungsbeziehung (QSAR) zielt darauf ab den Zusammenhang zwischen Ligandenstrukturen und ihren Bioaktivitätsdaten quantitativ zu beschreiben. Diesbezüglich haben wir einen Satz von 39 Chinolin-Derivaten der mGluR1 Antagonisten darstellt und kürzlich von Mabire und Mitarbeitern veröffentlicht wurde verwendet. Die Strukturen wurden flexibel in einer sinnvollen Anordnung überlagert und in einen Trainingsdatensatz (30 Moleküle) und einen Testdatensatz (9 Moleküle) aufgeteilt. Ein CoMFA-Modell das die beste Vorhersagefähigkeit besaß (q2(cv): 0,617) wurde erstellt. Zur statistischen Absicherung wurde derselbe Gesamtdatensatz zehnmal per Zufallsprinzip in Trainings- (20 Moleküle) und Testdatensatz (19 Moleküle) aufgeteilt was in einem mittleren q2(cv) von 0,507 (± 0,036) resultierte. Nachdem für das urprüngliche Modell Konturkarten, die sterische und elektrostatische Beiträge darstellten, berechnet worden sind wurde der Einfluss verschiedener Seitenketten auf die funktionelle Aktivität untersucht. Für einige Gruppe I mGluR Referenzverbindungen wurden, basierend auf den Ergebnissen der virtuellen Suche mit den Kohonen-Karten, Selektivitätsbetrachtungen durchgeführt. Die Kombination eines topologischen Pharmakophor-Deskriptors (CATS) und der SOMs wurde für die Vorhersage von multiplen Rezeptorinteraktionen von bekannten Gruppe I mGluR Antagonisten verwendet. Moleküle der mGluR Referenz-Sammlung und der COBRA Datenbank, die als Testdatensatz diente, wurden mit den CATS Deskriptor kodiert und einer Klassifizierung und Projektion gemäß dem SOM Algorithmus unterzogen. Für eine vorausgesagte Auswahl an Rezeptoren, darunter der muskarinische mACh (M1) Rezeptor, der Histamin H1-Rezeptor und die Dopamin D2/D3 Rezeptoren, konnten die gemessenen mGluR Liganden die berechneten Interaktionen aufweisen. Dieses Konzept des virtuellen Suchens könnte eine Basis für die frühe Erkennung von potentiellen Wechselwirkungen in der Arzneiforschung darstellen. Das Cumarin-Derivat C-07 wurde im Rahmen der Ähnlichkeitssuche mit dem CATS Deskriptor gefunden. Ausgehend von dieser Verbindung wurde in dem folgenden Aktivitäts- Optimierungsprogramm eine Reihe von chemischen Derivaten synthetisiert. Das führte zur Entdeckung von potenten (B-28, IC50: 58nM ± 8; Ki: 293nM ± 22) und selektiven (rmGluR5 IC50: 28,6 mikro M) mGluR1 Antagonisten. Auf Grundlage unseres Homologiemodells haben wir einen potentiellen Bindungsmodus für Cumarine innerhalb der transmembranen Region ermittelt, was am Beispiel von C-07 und B-28 gezeigt wurde. Es wurden potentielle Interaktionsmuster mit Aminosäuren vorgeschlagen, die auch den Unterschied der Bindetaschen vom Ratten- und Humanrezeptor berücksichtigen. Desweiteren wurden die vermuteten Bidungsmodi für Chinoline (hier: EMQMCM) und Cumarine (hier: B-04) verglichen und diskutiert, und zwar unter besonderer Berücksichtigung des Einflusses von verschiedenen Chinolin-Seitenketten auf die Aktivität gemäß den vorausgegangenen QSAR Studien. Die vorliegenden Untersuchungen veranschaulichen den Nutzen von ligandbasierten virtuellen Suchen für nichtkompetitive Antagonisten von G-Protein gekoppelten Rezeptoren was in der Auffindung neuer, potenter und selektiver Verbindungen mündete.