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Christian Werner

• Plattenepithelkarzinome des oberen Aerodigestivtraktes (SCCHN) sind Karzinome, die in den westlichen Industrienationen mit dem sechsten Rang in den Tumorstatistiken recht häufig sind. Ihre Inzidenz ist positiv mit einem erhöhten Tabak- und Alkoholkonsum und dem männlichen Geschlecht korreliert. Die Standardtherapie besteht in der Regel in einer operativen Sanierung und einer adjuvanten Radio- beziehungsweise Radio-Chemotherapie. Eine Induktionschemotherapie verspricht fortgeschrittene Primärtumoren und Tumoren vor einer operativen Intervention zu verkleinern. Jedoch besteht hierbei immer noch das Problem der hohen Rezidivfreundlichkeit dieser Tumoren, die wahrscheinlich mit der hohen Anzahl an G0-Phase-Zellen korreliert ist. Die vorliegende Arbeit hat die Frage untersucht, ob es möglich ist mit einer vorgeschalteten Stimulation durch Wachstumsfaktoren die Anzahl der G0-Phase-Zellen signifikant zu reduzieren und dadurch die gesamte Population der Tumorzellen sensibler für eine chemotherapeutische Intervention zu machen. Hierbei wurden besonders die Wachstumsfaktoren EGF und Serotonin als Stimulus verwendet. Die untersuchten Chemotherapeutika waren Mab425 und ZD1839, die die Signaltransduktion über einen EGFR-vermittelten Weg blockieren, sowie Docetaxel und Cisplatin, die als zytotoxische Substanzen wirksam sind. Die Untersuchungen wurden in vitro an drei Zelllinien durchgeführt. Detroit-562 und A431 bezogen wir von ATCC. Die Zelllinie UMSCC-10B wurde uns freundlicherweise von Thomas Carey von der University of Michigan zur Verfügung gestellt. Im Rahmen von Sondierungsversuchen stimulierten die Zellen mit IL-6, Serotonin, EGF und GCSF und fanden mit Hilfe der FACS-Analyse heraus, dass eine Kombination von EGF und Serotonin zur am stärksten ausgeprägten Stimulation der von uns untersuchten Zellen führte. In einem dreiphasigen Versuchsablauf wurden vier verschiedene Probengruppen untersucht. Zum einen eine Kontrollgruppe, die weder stimuliert noch chemotherapiert wurde. Eine Gruppe, die vor einer chemotherapeutischen Intervention mit Serotonin und EGF stimuliert wurde. Eine weitere Gruppe, die ausschließlich mit Serotonin und EGF stimuliert wurde und eine Gruppe, die nur eine Chemotherapie erhielt. Nach der Kultivierung der entsprechenden Proben, wurden die Zellen geerntet und zur Weiterverarbeitung vorbereitet. Es wurde mit Hilfe der Western-Blot-Analyse die Aktivität der Proteine untersucht, die an der über EGFR vermittelten Signaltransduktion beteiligt sind. Dazu wurden Antikörper gegen Proteine der Signaltransduktion eingesetzt, die dann mit Hilfe von zweiten Antikörpern erkannt wurden. Zum anderen wurden immunhistochemische Zellausstriche angefertigt mit einer Antikörperfärbung gegen das Kernprotein Ki-67, die uns zwischen proliferierenden und nichtproliferierenden Zellen unterscheiden ließ. Es erfolgte eine Auswertung der Gesamtzellanzahl bezogen auf die Reduktion der G0-Phase-Zellen. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des Mann-Withney-U-Tests und des Wilcoxon- Tests. Hierbei lag das Signifikanzniveau bei 5%. Als Ergebnis kann man festhalten, dass eine signifikante Reduktion der Anzahl an G0-Phase-Zellen bei einer Vorstimulation und anschließender Chemotherapie durch Docetaxel oder Cisplatin zu beobachten war. Eine chemotherapeutische Intervention durch Mab425 und ZD1839 führte zwar zu einer Reduktion der Zellanzahl, aber nicht zu vergleichbar signifikanten Ergebnissen wie bei einer Intervention mit Docetaxel oder Cisplatin. Hieraus lässt sich der Schluss ableiten, dass eine chemotherapeutische Intervention auf Basis einer Blockade der durch EGFR vermittelten Signaltransduktion nicht ausreichend ist, es also einer zytotoxischen Komponente bedarf, um die Gesamtzellzahl signifikant zu reduzieren. Trotzdem nicht bei allen untersuchten Chemotherapeutika eine signifikante Reduktion der G0-Phase-Zellen beobachtet werden konnte, zeigten unsere Untersuchungen zum ersten Mal, dass durch eine Stimulation mit Wachstumsfaktoren vor einer chemotherapeutischen Intervention, die Sensibilität der Tumorzellen bei SCCHN für eine Chemotherapie durch eine Reduktion der G0-Phase-Zellen erhöht wird.
• Squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN) is a cancer which is widespread in the industrialised countries of the world. The incidence is positively correlated with the abnormal use and consumption of tobacco and/or alcohol and the male gender. The treatment of choice is to do surgery and afterwards an adjuvant radio- or radiochemotherapy. The aim of a first line chemotherapy (induction chemotherapy) is to minimize the consisting tumour masses before a surgical intervention is done. Nevertheless one of the major problems concerning the response of SCCHN to chemotherapy is the high percentage of resting cells (G0-phase cells) being resistant to chemotherapy. To overcome this problem we have investigated the capacity of several cytokines, namely Serotonin and EGF to transfer resting cells into an active state of the cell cycle and progress to chemosensitive phases (S, M-phase). Chemotherapeutical agents we used included Mab425, ZD1839, Docetaxel and Cisplatin. We investigated with Mab425 and ZD1839 the blocking of an EGFR-controlled pathway of the cell activation. Docetaxel and Cisplatin are cytotoxic agents. All our investigations were done with SCCHN cells. Detroit-562 and A431 are cells we received from ATCC. Thomas Carey of the University of Michigan kindly provided UMSCC-10B. IL-6, Serotonin, EGF and GCSF were used to stimulate G0-phase SCCHN cells for re-entry in the cell cycle to enhance the response to chemotherapeutical intervention. The proportion of G0-phase cells was detected through multicolour FACS analysis and Ki-67 staining. We found that the most effective combination was Serotonin and EGF. We cultivated four different groups of samples. One was the control group which received no treatment. One of the groups received stimulation with Serotonin and EGF and afterwards chemotherapeutical intervention. Another group only received stimulation with Serotonin and EGF and one group only received chemotherapeutical intervention. After cultivation, cells were harvested and prepared for either Western-Blot analysis or Ki-67 staining. With Western-Blot analysis we investigated the proportion of activated proteins in the EGFR transduced pathway of cell activation. Ki-67 staining helped us to divide between activated and resting cells. We analyzed the total cell amount compared to the reduction of G0-phase cells. For statistical analysis we used the Mann-Withney-U-test and Wilcoxon-test in SPSS (version 9.0). The significance was 5%. Our investigations demonstrate for the first time that sensitizing G0 phase SCCHN cells for chemotherapeutical treatment is possible by prestimulation with target cytokines. A prestimulation before a chemotherapeutical intervention with Docetaxel or Cisplatin led to significant reduction of G0 phase cells (p<0,04). This effect could also be seen by chemotherapy with Mab425 or ZD1839 but it was not as significant as it was with Docetaxel or Cisplatin. Concluding this we could see that a cytotoxic mechanism is necessary to reduce the total amount of tumour cells.