Investigations on subunit-specific assembly and structure-function studies of the voltage sensor in KCNQ potassium channels

  • A detailed understanding of how potassium channels function is crucial e. g. for the development of drugs, which could lead to novel therapeutic concepts for diseases ranging from diabetes to cardiac abnormalities. An improved understanding of channel structure may allow researchers to design medication that can restore proper function of these channels. This is particularly important for KCNQ channels, since four out of five family members are involved in human inherited disease. In addition to structure and function relationships the determinants which govern assembly of KCNQ subunits are decisive to understand the physiological role of the KCNQ channel family members. Many details of KCNQ channel assembly remain incompletely understood. Previous work has shown that the subunit-specific heteromerisation between KCNQ subunits is determined by a ~115 amino acid-long subunit interaction domain (si) within the C-terminus (Schwake et al., 2003). Recently, Jenke et al. (2003) proposed that the C-terminal domains in eag and erg K+ channels act as sites which drive tetramerization. From their ability to form coiled coils, these domains were referred to as tetramerizing coiled-coil (TCC) sequences. Jenke et al. also pointed out that KCNQ channels contain bipartite TCC motifs within their C-termini, exactly within the si domain, which is responsible for the subunit-specific interaction pattern. The first part of this thesis was dedicated to determine the individual role of these TCC domains on homomeric and heteromeric channel formation in order to further characterize the molecular determinants of KCNQ channel assembly. In the second part of this thesis cystein-scanning mutagenesis was employed, followed by thiol-specific modification using MTS reagents to screen more than 20 residues in the S3-S4 linker region and in the S4 transmembrane domain of the KCNQ1 channel to gain information about residue accessibility, the functional effects of thiol-modifying reagents (MTSES), and effects of crosslinking selected pairs of Cys residues by Cd+ ions, which could be used for testing model predictions based upon known Kv channel structures from the literature. According to homology modelling based on the Kv1.2 structure it was attempted to determine the proximity of individual residues from different transmembrane segments using the metal bridge approach (crosslinking by Cd+ ions). This led us to derive structural constraints for interactions between the S4 voltage sensor and adjacent transmembrane segments of KCNQ1. Similar studies have previously been performed on the Shaker K+ channel, which has served as a paradigm for structure-function research of voltage-gated K+ channels for a long time, but little is known for KCNQ channels concerning their similarity to published K+ channel structures.
  • Die Fähigkeit von KCNQ-(Kv7)-Kanälen Hetero-Oligomere aus verschiedenen KCNQ-Untereinheiten zu bilden, ist von hoher physiologischer Bedeutung, da Heteromere von KCNQ3 mit KCNQ2 oder KCNQ5 dem neuronalen M-Strom zugrunde liegen, welcher die neuronale Erregbarkeit moduliert. Die fünf Mitglieder dieser Familie (KCNQ1-KCNQ5) sind homolog zu Shaker Kanälen jedoch unterscheiden sie sich in ihrer Struktur dadurch, daß die KCNQ-Kanäle längere Carboxytermini haben, die intrazellulär lokalisiert sind. Außerdem führen Mutationen bei vier von den fünf Mitgliedern dieser Familie (KCNQ1-KCNQ4) zu genetischen Störungen. KCNQ1-Mutationen verursachen das Romano-Ward-Syndrom (RWS), eine Sonderform (Typ1) des Long-QT-Syndroms (LQT). Dieser Name leitet sich von der charakteristischen Verlängerung des QT–Intervalls im Elektrokardiogramm ab. Dabei handelt sich um eine dominant vererbliche Repolarisations-Störung des Herzmuskels. Diese kann Ursache für Herzrhythmusstörungen sein, die häufig zu plötzlichen Herztod führen. Bestimmte rezessive KCNQ1- und KCNE1-Mutationen sind zudem für das Jervell-und-Lange-Nielsen-Syndrom verantwortlich. Bei dieser Mutation leiden die Patienten zusätzlich zu kardialen Abnormalitäten auch noch unter progressiver Taubheit. KCNQ2- und KCNQ3-Mutationen verursachen die dominant vererbliche Form der Neugeborenenepilepsie „benign famillial neonatal convulsions“ (BFNC). Die molekulargenetische Ursache dieser Erkrankung ist ein KCNQ2/KCNQ3-Heteromer. Diese K+-Kanal-Untereinheiten werden hauptsächlich im Gehirn exprimiert und repräsentieren das molekulare Korrelat des sogenannten M-Stroms, welcher über muskarinerge Stimulation (M1-Rezeptoren) reguliert wird. KCNQ4-Mutationen können eine dominant vererbliche Taubheitsform, DFNA2 genannt, verursachen. Der KCNQ5-Kanal weist ein breites Expressionsmuster auf, für den aber noch keine Beteiligung an menschlichen Erbkrankheiten nachgewiesen werden konnte. Innerhalb dieser Familie unterscheiden sich KCNQ1 und KCNQ3 am meisten hinsichtlich ihrer Eigenschaft, Heteromere mit anderen KCNQ-Untereinheiten zu bilden. Im C-Terminus von KCNQ-Kanälen wurde vor kurzem eine ca. 100 Aminosäuren umfassende Domäne identifiziert, welche die Spezifität des Untereinheiten-Zusammenbaus bestimmt. Innerhalb dieser sog. si-Domäne gibt es zwei Abschnitte, die jeweils aus ~30 Aminosäuren bestehen und eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer coiled-coil-Struktur aufweisen. Durch Übertragung der ersten oder der zweiten coiled-coil- bzw. TCC-Domäne von KCNQ3 auf KCNQ1 wurden KCNQ1(TCC1)Q3- und KCNQ1(TCC2)Q3-Chimären generiert, die sich beide mit KCNQ2 koimmupräzipitieren ließen. Allerdings konnte nur mit KCNQ1(TCC2)Q3 eine Erhöhung der Ströme und der Oberflächenexpression in Koexpression mit KCNQ2 beobachtet werden, wie sie für die KCNQ2/KCNQ3-Interaktion charakteristisch ist. Die Deletion von TCC2 innerhalb von KCNQ2 resultierte zwar in funktionalen homomeren Kanälen, es entfiel jedoch die Zunahme des Stromes nach der Koexpression des Deletionskonstrukts mit KCNQ3. Im Gegensatz dazu konnten nach Deletion von TCC1 innerhalb von KCNQ2 keine funktionalen homomeren KCNQ2- bzw. heteromere KCNQ2/KCNQ3-Kanäle beobachtet werden. Auch hoben Mutationen, die die vorhergesagte coiled-coil-Struktur von TCC1 in KCNQ2 oder KCNQ3 unterbrachen, die funktionelle Expression dieser Konstrukte einzeln oder in Kombination mit der jeweils intakten anderen Untereinheit auf. Demgegenüber waren homomere KCNQ2-Kanäle mit helix-brechenden Mutationen in TCC2 zwar funktionell, es unterblieb jedoch die Heteromerisation mit KCNQ3. Im Gegensatz dazu hetero-oligomerisierte ein KCNQ3-Konstrukt mit einer coiled-coil-brechende Mutation in TCC2 weiterhin mit KCNQ2. Die Daten in dieser Arbeit unterstreichen, dass die TCC1-Domänen von KCNQ2 und KCNQ3 notwendig sind, funktionale homomere als auch heteromere Kanäle zu bilden, während beide TCC2-Domänen für einen effizienten Transport heteromerer KCNQ2/KCNQ3-Kanälen zur Plasmamembran verantwortlich sind. Die funktionellen Eingenschaften von KCNQ-Kanälen unterscheiden sich in vielerlei Hinsicht deutlich von z. B. denen von Shaker K+-Kanälen aus Drosophila , welche als am besten untersuchte Kv-Kanäle betrachtet werden können. Um einen systematischen Beitrag zu Struktur-Funktions-Beziehungen an KCNQ-Kanälen zu erbringen, wurde im zweiten Teils dieser Arbeit der Versuch unternommen, den Einfluss verschiedener Aminosäuren-Seitenketten durch eine Cystein-Scanning-Mutagenese im Bereich des S4-Segments und der vorangehenden S3-S4-Schleife von KCNQ1 zu analysieren. Um die extrazelluläre Zugänglichkeit der eingeführten Cysteine zu detektieren, wurde nach Effekten extrazellulärer Applikation der thiol-spezifisch reagierenden Substanz MTSES auf die funktionellen Eigenschaften der Kanäle gesucht. Alle 20 untersuchten Cystein-Mutanten konnten in Xenopous Oozyten funktionsgemäß exprimiert werden, mit Ausnahme der Mutanten L233C. Die exprimierten Mutanten erzeugten charakteristische Kv-Kanal-ähnliche Ströme. Wie zu erwarten war, führten die untersuchten Mutanten zu signifikanten Verschiebungen des V0.5-Wertes, verglichen mit denen des KCNQ1 Wildtyps. Interessant zu beobachten war, daß Mutanten, die eine Verschiebung des V0.5-Wertes in Richtung negativen Potentials zeigten, sich zwischen G219C und F222C (miteinbezogen auch Positionen G216C und Q234C) befanden. Mutanten die eine positive Verschiebung aufwiesen, waren mehr C-terminal lokalisiert: A223C, T224C, S225C, A226C, G229C, I230C, F232C und I235C. Eine Ausnahme hierzu bildet die Mutante S217C. Eine negative Verschiebung des V0.5-Wertes kann als Stabilisierung des offenen Kanalzustandes beziehungsweise als Destabilisierung des geschlossenen Kanalzustands betrachtet werden, da kleinere Depolarisationen schon ausreichen, um den mutierten Kanal zu aktivieren. Das genaue Gegenteil der obig beschriebenen Situation gilt bei positiven Verschiebungen des V0.5-Wertes, d.h. Stabilisierung des geschlossenen bzw. Destabilisierung des offenen Kanalzustands. Deswegen tendieren Mutationen im N-terminalen Bereich des S4 Segments dazu, den geschlossenen Zustand des Kanals zu destabilisieren. Wohingegen Cystein-Substitutionen weiter abwärts des S4 Segments gelegen vorzugsweise zur Stabilisierung den geschlossenen Kanalzustands führen. Von den 20 untersuchten Mutanten wiesen die Konstrukte A223C bis I227C, I230C, G219C sowie Q234C z.T. drastische Veränderungen nach Inkubation mit MTSES auf, wodurch die extrazelluläre Zugänglichkeit der betreffenden Positionen eindeutig belegt wird. Von den untersuchten Konstrukten, wiesen die Mutanten T224C und S225C in ihrem Verhalten bei depolarisierenden Spannungssprüngen nach MTSES-Inkubation eine Restaktivierung auf. Dagegen zeigten die Ströme, die bei den Mutanten A223C, A226C und I230C aufgenommen wurden, daß diese mit MTSES modifizierten Kanäle bei stark hyperpolarisierenden Potentialen zu einem Deaktivierungszustand getrieben werden können. Die beobachteten Veränderungen in der Stromcharakteristik konnten mit der hyperpolarisierenden Verschiebung des V0.5-Wertes korreliert werden. Dies bedeutet, daß die kovalente Anknüpfung der MTSES-Seitengruppe, das spannungssensitive S4 Segment verhindert, wieder zurück zu einer Kanal-Konformation zu gelangen, welche die Schließung des Kanals ermöglicht. In den meisten Fällen führte die kovalente Anknüpfung der MTS-Seitengruppe zu einem Erscheinungsbild, wie es für konstitutiv offene Kanäle charakteristisch ist. Auch im Falle der Cystein-Insertion an der Spannungssensor-Position R228 waren charakteristische Veränderungen nach MTSES-Zugabe zu beobachten. Die R231C-Mutante (ebenfalls eine der Schaltladungen betreffend), zeigte bereits vor der MTSES-Applikation einen Offenkanal-Phänotyp, infolge MTSES-Zugabe trat keine weitere Veränderung auf. Basierend auf der Kristallstruktur des spannungsgesteuerten Kv1.2-Kanals wurde ein Strukturmodell von KCNQ1 konstruiert, welches dazu diente, potentielle Aminosäure-Positionen innerhalb anderer Transmembrandomänen von KCNQ1 vorzuschlagen, die in unmittelbarer Umgebung der MTSES-zugänglichen S4-Positionen liegen könnten. Dementsprechend wurden Doppelmutanten mit je einem Cystein auf dem S4-Segment und einem auf einer anderen Helix untersucht. Zuvor wurde der KCNQ1-Wildtyp und die einzelnen Cystein-Mutanten auf Cd2+ Sensitivität getestet. Eine Konzentration von 100μM wurde als optimal bestimmt, da keine funktionellen Veränderungen der Kanäle bei dieser Konzentration beobachtet werden konnten. Von den vier vorgeschlagenen Cystein-Paaren konnte für die Kombinationen I230C/M159C und T224C/F279C mittels Cd2+-Quervernetzungsversuchen eine enge Nachbarschaft zwischen den entsprechenden Aminosäure-Positionen gezeigt werden. In beiden Fällen konnte eine Reduktion der steady-state Stromamplituden beobachtet werden, die parallel einherging mit einer entsprechend signifikanten Erniedrigung der Sättigungskurve I/Imax. Beide Beobachtungen sind ein Indiz dafür, daß die obig genannten Doppelcystein-Mutanten sich mit Cd2+ quervernetzen. Diese Quervernetzung führt zu strukturellen Einschränkungen, welche das Öffnen des Kanals verhindern. Die beobachteten funktionellen Konsequenzen der Cd2+-Quervernetzung lassen sich im Sinne einer Stabilisation des Geschlossen-Zustands des Kanals interpretieren. Diese Befunde belegen die Gültigkeit des erstellten Struktur-Modells, welches auf der Kristallstruktur eines geschlossenen Kv-Kanals beruhte.

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Metadaten
Author:Despina Athanasiadu
URN:urn:nbn:de:hebis:30-52253
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Ernst BambergGND, Thomas Friedrich
Advisor:Thomas Friedrich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2008/01/18
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2007/11/23
Release Date:2008/01/18
GND Keyword:Nervensystem; Neurowissenschaften; Membranproteine; Carrier-Proteine
Page Number:115
First Page:1
Last Page:107
HeBIS-PPN:194379043
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht