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Gunnar Thorben Rembert Hischebeth

• Die spinale Kompression bei Wirbelsäulenfrakturen löst eine komplexe Abfolge von pathophysiologischen Ereignissen aus. Dem neuronalen Primärschaden, der unmittelbar durch das Trauma entsteht, folgt ein Sekundärschaden, der durch die Aktivierung immunkompetenter Zellen vermittelt wird. Durch die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine und anderer potentiell neurotoxischer Faktoren wie Interleukin (IL)-1, IL-6, Tumor Nekrose Faktor (TNF)-&#945;, Stickstoffmonoxid (NO) oder freier Radikale wird der initial entstandene Primärschaden verstärkt. Um die Hypothese zu prüfen, dass eine Hemmung von immunkompetenten Zellen mit dem Immunsuppressivum Mycophenolatmofetil (MMF) zu einem verbesserten Erhalt neuronaler Strukturen führt, wurde das etablierte Modell der organotypischen hippocampalen Schnittkultur (OHSC) gewählt. In diesem Modell können die komplexen Vorgänge der neuronalen Schädigung und der glialen Aktivierung exzellent dargestellt werden, da die verschiedenen Zelltypen des Hirngewebes in organotypischer Anordnung erhalten bleiben. Die reproduzierbare experimentelle Schädigung der OHSC wurde am 6. Tag in vitro (div) durch exzitotoxische Behandlung mit N-Methyl-d-Aspartat (NMDA; 50 &#956;M; 4 h) erzielt. Zeitgleich mit der Schädigung mittels NMDA und weiter bis zum Fixationszeitpunkt nach 9 div wurde das Immunsuppressivum MMF verabreicht. Die mit NMDA geschädigten Schnittkulturen zeigten einen dramatischen neuronalen Schaden und eine starke Zunahme der Zahl der Mikrogliazellen. Die hier nach quantitativer Analyse mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie ermittelten Korrelate des neuronalen Schadens, also die Zahl mit Propidiumiodid (PI) angefärbter, lädierter Neurone, und die Zahl der mit Griffonia simplicifolia (IB4) markierten Mikrogliazellen, wurden auf einen Wert von 100% normalisiert. Die Kontrollkulturen zeigten im Vergleich zu den geschädigten Kulturen fast keinen neuronalen Schaden (1,1% PI-markierte Zellen verglichen mit 100% in der mit NMDA geschädigten Gruppe, p<0,05), und nur wenige, ruhende Mikrogliazellen (13,8%, p<0,05). Nach Schädigung mittels NMDA und gleichzeitiger Verabreichung von MMF (10 &#956;g/ml) zeigte sich eine signifikante Reduktion der Zahl PI-markierter Neurone auf 51,0% (p<0,05) und der Zahl der Mikrogliazellen auf 47,1 % (p<0,05), jeweils verglichen mit der NMDA-Gruppe. Bei der Verwendung von MMF in höherer Konzentration (100 &#956;g/ml) wurden Werte von 50,4 % (p<0,05) für den neuronalen Schaden und 31,9 % (p<0,05) für die Zahl der Mikrogliazellen ermittelt. Die Kurzzeitverabreichung von MMF in einer Konzentration von 100 &#956;g/ml für nur 4 Stunden parallel mit der exzitotoxischen Schädigung mittels NMDA resultierte nur in einer signifikanten Verminderung der Anzahl Mikrogliazellen auf 34,9% (p<0,01), nicht hingegen in einer signifikanten Reduzierung des neuronalen Schadens. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass MMF einen antiproliferativen Effekt auf Gliazellen hat. Mittels Ki67-Färbung konnte nach Gabe von MMF im Vergleich zu den nur mit NMDA geschädigten Kulturen (100%) ein Rückgang der Zahl proliferierender Ki67+-Gliazellen auf 21,9% (MMF 10 &#956;g/ml; p<0,01) bzw. 17% (MMF 100 &#956;g/ml; p<0,01) gezeigt werden. Ferner wurden viele Zellen gesehen, die nach MMF-Gabe fragmentierte Kerne aufwiesen. Dieses Phänomen wurde als Zeichen von apoptotischen Vorgängen in Gliazellen aufgefasst. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass MMF den neuronalen Schaden und das Ausmaß der Mikrogliaaktivierung um ca. 50% reduziert. Zusätzlich wurde belegt, dass MMF einen antiproliferativen Effekt auf Mikrogliazellen und Astrozyten hat. Die Befunde sprechen für die genauere Charakterisierung der ermittelten neuroprotektiven Effekte in einem in vivo-Modell der spinalen Kompression.
• Spinal cord compression induces a complex cascade of pathophysiological events. Neuronal primary damage that is induced immediately after the trauma is followed by secondary damage that is caused by activation of immunocompetent cells. The release of proinflammatory cytokines and potential neurotoxic factors, e.g. interleukin (IL)-1, IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-&#945;, NO or free radicals leads to an exacerbation of the initial primary damage. To investigate the hypothesis that an inhibition of immunocompetent cells by the immunosuppressant mycophenolate-mofetil (MMF) results in an improved preservation of neuronal structures, the established model of organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) was used. The complex interactions of damaged neurons with glial cells can be studied in this model, because all cells of the central nervous system are preserved in an organotypic arrangement. Experimental damage to OHSC was induced after 6 days in vitro (div) by an excitotoxic treatment with N-methyl-d-aspartate (NMDA; 50 &#956;M; 4h). Simultaneously with NMDA treatment the immunosuppressant MMF was added and continuously applied until fixation after 9 div. OHSC that were treated with NMDA showed dramatic neuronal damage and an increase in the number of activated microglial cells. The correlates of neuronal damage, i.e. the number of propidium iodide (PI)-stained neurons and the number of Griffonia simplicifolia IB4-stained microglial cells were quantitatively analyzed by confocal laser scanning microscopy and normalized to 100%. The control group of intact OHSC showed nearly no neuronal damage (1.1% PI+-neurons compared to 100% in the NMDA group, p<0.05) and only few, resting microglial cells (13.8% IB4+-microglial cells, p<0.05) compared with the NMDA group. After lesioning of OHSC with NMDA and simultaneous and subsequent treatment with MMF (10 &#956;g/ml) a significant decrease in the amount of neuronal damage (51.0% PI+-neurons, p<0.05) and a significant reduction in the number of IB4+-microglial cells (47.1%, p<0.05) was observed, each compared to the NMDA group. Using MMF at a higher concentration (100 &#956;g/ml) an even more pronounced reduction of neuronal damage (50.4% PI+-neurons, p<0.05) and microglial numbers (31.9% IB4+-microglial cells, p<0.05) was observed. Short-term application of MMF (100 &#956;g/ml) for only 4 hours parallel to the excitotoxic injury with NMDA resulted in a significant reduction in the number of IB4+-microglia cells (34.9%, p<0.01), but not in a significant reduction of neuronal damage. Furthermore, it was shown that MMF has antiproliferative effects on glial cells. Ki67 staining after addition of MMF (10 &#956;g/ml) to the OHSC revealed a significant reduction in the number of proliferating Ki67+-glial cells to 21.9%, (p<0.01) compared to OHSC treated with NMDA alone (100%). Treatment with MMF (100 &#956;g/ml) induced a reduction to 17.0% (p<0.01). Furthermore, many glial cells showed nuclear fragmentation after MMF treatment, indicating apoptotic processes. These results demonstrate that MMF reduces neuronal damage and microglial activation approximately by half. Furthermore, an antiproliferative effect of MMF on glial cells was found. The results support further characterization of the neuroprotective effects of MMF in an in vivo-model of spinal cord compression.