Open Access

Anna Alexandra Laura Greening

• In this thesis I have investigated the regulation of eicosanoid synthesizing-enzymes by cannabinoid receptor agonists. Rat renal mesangial cells were used as a model system. I could show that all three (CB1, CB2, and GPR55) cannabinoid receptors are expressed on the mRNA level in rat renal mesangial cells – but with differing expression profiles. The CB1 and GPR55 receptors are expressed in comparable amounts, whereas the CB2 receptor is considerably less expressed than the CB1 and the GPR55 receptors. Furthermore I could show that stimulation of renal mesangial cells with CB1 receptor agonists, such as R(+)MA or ACEA, increased IL-1β-induced cPLA2, sPLA2-IIa, and COX2 protein and mRNA expression which subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Additionally, the IL-1β- induced sPLA2-IIa promoter activity was also increased by CB1 receptor stimulation. Besides the modulated expression of the eicosanoid synthesizing enzymes, I could show that CB1 agonists also led to an increase of IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation. In contrast, stimulation with CB2 selective agonists led to a decrease in IL-1β- induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. Accordingly, the IL-1β-induced sPLA2-IIa promoter activity was also reduced by CB2 receptor agonists. IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation were not influenced by CB2 recptor activation. Matching the results I obtained with CB1 receptor agonists on IL-1β-induced PGE2 formation, I could observe an increased cPLA2 protein and mRNA expression with a subsequent increase in IL-1β-induced PGE2 formation by GPR55 stimulation. Stimulation with THC, an unselective CB agonist, increased the IL-1β-induced sPLA2-IIa protein expression and subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Subjecting the cells to higher THC concentrations surprisingly led to a reduction of the IL-1b-induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. A possible explanation may be the differential expression of the three CB receptors. At low concentrations THC may predominantly activate CB1 and GPR55 and with increasing concentration CB2 receptors may also be activated, slightly reversing the enhancing effect. Moreover, I could show that the CB1 receptor stimulation mediated phosphorylation and hence the activation of ERK1/2 MAPK. Additionally to ERK1/2, there was also a phosphorylation and activation of NFkB observed by CB1 receptor stimulation. In my thesis I could show for the first time that PPARα was activated by IL-1β in rMC. The IL-1β-induced PPARα promoter activity was completely inhibited by addition of the CB2 receptor agonist, JWH015. These findings were confirmed by inhibition of the IL-1β-induced PGE2 formation by a PPARα antagonist (MK-886). In summary, I could show that activation of CB1 receptors in our system led to a worsening of an inflammatory condition, whereas activation of the CB2 receptors led to the complete opposite; namely a reduction of the inflammatory response by reducing the sPLA2-IIa expression and PGE2 formation. GPR55 activation did not display any alteration of inflammatory conditions, since the classical inflammatory pathway was not influenced.
• In der vorliegenden Dissertation wurde die Regulation Eikosanoid-synthetisierender Enzyme durch Cannabinoid-Rezeptoragonisten untersucht. Als Modellsystem wurden renale Ratten Mesangiumzellen verwendet. Das Mesangium dient als Stabilisator der Gefäßwände, welches durch Bildung eines Achsenskeletts, die Kapillaren des Glomerulus am Gefäßpol befestigt. Das Mesangium besteht aus Mesangiumzellen, welche glatte kontraktionsfähige Muskelzellen sind und sich am Gefäßpol des Glomerulus befinden von welchem aus sie in das Gefäßknäuel einstrahlen. Sie können den Blutfluss durch die glomerulären Kapillaren beeinflussen. Unter entzündlichen Bedingungen im Glomerulus interagieren die Mesangiumzellen aktiv mit einwandernden Immunzellen. Aktivierte Mesangiumzellen sind in der Lage, selbst bioaktive Moleküle (wie Eikosanoide, Stickoxid (NO), Wachstumsfaktoren oder entzündlich wirkende Zytokine) zu produzieren und vermehrt extrazelluläre Matrix zu bilden. Darüber hinaus beginnen sie verstärkt zu proliferieren. Bei chronischentzündlichen Bedingungen in der Niere, wie Glomerulonephritiden, führt dies zu einer irreversiblen Veränderung der Glomerulusstruktur in Form einer Glomerulosklerose, welche dann zu einem Nierenversagen führen kann. Die Phospholipasen A2 hydolysieren membranäre Phospholipide an der sn-2 Position, wodurch sie freie Fettsäuren und Lysophospholipide produzieren. Dadurch katalysieren Sie den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Produktion der Eikosanoide, indem sie deren Vorläufermolekül, die Arachidonsäure, freisetzen. Durch die Bereitstellung von Lysophospholipiden (dem Vorläufermolekül des platelet-activating factor) und der Arachidonsäure, spielen die Phospholipasen A2 eine entscheidende Rolle in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Unter physiologischen Bedingungen in der Niere sind die Phospholipasen A2 and der Produktion von Prostaglandinen E2 (PGE2) und Prostacyclinen, welche durch ihre vasodilatatorischen Eigenschaften eine wichtige Rolle bei der Regulation der glomerulären Filtrationsrate spielen maßgeblich beteiligt. Unter anderem sind die Phospholipasen A2 auch an pathophysiologischen Bedingungen der Niere, wie Glomerulonephritis und Glomerulosklerose beteiligt. In den Ratten Mesangiumzellen sind bisher vier Phospholipasen A2 identifiziert worden: die zytosolische PLA2 (cPLA2), die kalziumunabhängige PLA2 (iPLA2), sowie die sekretorischen Gruppen IIa und V PLA2. Unter Einfluss entzündlich wirkender Zytokine wie IL-1β oder TNFα wird die Protein- und mRNA-Expression der Gruppe IIa PLA2 (sPLA2-IIa) induziert, und es kommt zu einer erhöhten Expression von cPLA2 und Cyclooxygenase 2 (COX2). Dies führt schließlich zu erhöhter Produktion von PGE2. Ein weiterer Entzündungsmarker, der durch entzündliche Zytokine beeinflusst wird, ist die Bildung von NO durch die induzierbare NO-Synthase (iNOS). Cannabinoide sind für ihre medizinischen Eigenschaften bekannt. Sie werden als potentielle Pharmaka für die Behandlung von Schmerzen und Entzündungen diskutiert und bereits bei der Behandlung von Nausea und Emesis, sowie bei Appetit- und Gewichtsverlust von bei Chemotherapie-Patienten und AIDS-Patienten eingesetzt. Cannabinoide binden an Cannabinoid-Rezeptoren, von denen bisher drei, nämlich die CB1-, CB2- und GPR55-Rezeptoren, identifiziert wurden, welche zu der Klasse der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, charakterisiert durch sieben Transmembrandomänen, gehören. Sie besitzen unterschiedliche Expressionsmuster, d.h. die CB1-Rezeptoren sind hauptsächlich im zentralen Nervensystem und in Zellen des Immunsystems, aber auch in peripheren Organen exprimiert. Die CB2-Rezeptoren hingegen werden hauptsächlich in Zellen des Immunsystems und in peripheren Organen exprimiert, wurden aber auch zu einem geringen Anteil im zentralen Nervensystem gefunden. Der jüngst als Cannabinoid-Rezeptor identifizierte GPR55-Rezeptor wurde auch im zentralen Nervensystem und in peripheren Organen gefunden. In vorherigen Studien konnte gezeigt werden, dass Cannabinoide in der Lage sind, die PGE2- Freisetzung zu modifizieren. Chang et al. haben gefunden, dass der unselektive Cannabinoid- Rezeptoragonist, THC, die LPS-induzierte PGE2-Freisetzung hemmt. Im Gegensatz dazu konnten Burstein und Kollegen zeigen, dass Stimulation von humanen Lungen-Fibroblasten (WI-38) mit THC zu einer (durch eine nicht weiter identifizierte) PLA2- und COX-vermittelten Erhöhung der PGE2-Freisetzung führt. Rösch et al. haben gefunden, dass selektive CB1-Rezeptoraktivierung in humanen Neurogliomazellen durch R(+)MA zu einer Erhöhung der COX2-Expression und somit zu einer erhöhten Bildung und Freisetzung von PGE2 führt. Aufgrund dieser Publikationen, in welchen sehr unterschiedliche Entdeckungen in Bezug auf PGE2-Freisetzung gemacht wurden, waren wir interessiert, die genauen Effekte selektiver CB1-, CB2- und GPR55-Rezeptoragonisten sowie unselektiver CB-Rezeptoragonisten auf sPLA2 und cPLA2 sowie anderer Enzyme der Arachidonsäurekaskade zu untersuchen und folglich auch auf die PGE2-Freisetzung. ...