Entwicklung von retroviralen Vektoren zum selektiven Gentransfer in hämatopoetische Vorläuferzellen und Untersuchungen zur R-Peptid vermittelten Membranfusion bei gamma-Retroviren

Development of retroviral vectors for selective gene transfer into haematopoietic precursor cells and investigation of the gamma-retroviral R-peptide mediated membrane fusion

  • Eine in vivo Modifizierung von Blutstammzellen wäre für eine Reihe gentherapeutischer Therapieansätze vorteilhaft. Dies würde voraussetzen, dass retrovirale Vektoren gezielt auf Blutstammzellen ausgerichtet werden können. Für dieses sogenannte Zelltargeting bietet sich das vom Milznekrose-Virus von Vögeln (SNV) abgeleitete Vektorsystem an, bei dem die Rezeptorbindungsdomäne des Env-Proteins modifiziert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein SNV-basierter retroviraler Zelltargeting-Vektor entwickelt werden, der einen selektiven Gentransfer in die primären humanen CD34-positiven hämatopoetischen Zellen ermöglicht. Zur weitergehenden Charakterisierung des SNV-Vektorsystems sollte geklärt werden, ob das Env-Protein des SNV ein mit anderen gamma-retroviralen Env-Proteinen vergleichbares R-Peptid aufweist, dessen mögliche Rolle bei viralem Zelleintritt ebenfalls untersucht werden sollte. Um eine Zielzell-Spezifität des SNV-Vektors zu erreichen, wurde die gesamte SU-Domäne des SNV-Env-Proteins mit einem einkettigen Antikörperfragment (scFv) ersetzt, das gegen das CD34 Molekül gerichtet ist,. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [(antiCD34-TM)SNV]-Vektorpartikel herzustellen, die spezifisch CD34-positive Zellen transduzierten. Essentiell für die Erzeugung solcher Vektoren war die Etablierung einer stabilen Verpackungszelllinie, die Vektorpartikel mit einem Titer von 2x105 i.E./ml produzierte. In Transduktionsexperimenten mit verschiedenen Zelllinien wurde gezeigt, dass [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren eine deutliche Präferenz für CD34+-Zellen und nicht für CD34--Zellen besitzen, wobei der Unterschied in der Transduktionseffizienz zwischen CD34-positiven und –negativen Zellen um den Faktor 100 lag. [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren waren in der Lage, den Reportergentransfer auch in primäre humane Stammzellen zu bewirken. Hierzu wurde ein Transduktionsprotokoll so optimiert, dass die aus dem Nabelschnurblut isolierten CD34+-Zellen transduziert werden konnten. Der für diese Zielzellen bestimmte Vektortiter betrug bis zu 2x106 i.E./ml. In einem Gemisch von primären CD34+- und CD34--Zellen konnte der Vektor zwischen dem Target- und Nontarget-Zellen unterscheiden. Somit wurde zum ersten Mal nicht nur Spezifität, sondern auch Selektivität des SNV-Vektorsystems demonstriert. Dieses Ergebnis ist für eine Weiterentwicklung des Vektors für die in vivo Anwendung in Rahmen einer Gentherapie eine wichtige Voraussetzungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Fusionsvorgang bei Virus-Eintritt näher untersucht. Anlass dafür war die experimentelle Beobachtung, dass das Env-Protein des SNV bei der Virusknospung von einer viralen Protease innerhalb der zytoplasmatischen Domäne proteolytisch gespalten wird. Ein Sequenz-Vergleich des SNV TM-Proteins mit dem MLV TM-Protein ergab Hinweise darauf, dass es sich um die Abspaltung des sogenannten R-Peptides analog zu MLV handeln könnte. Die Expression von SNV-Env- Mutanten mit einem entsprechend verkürzten C-Tail (Env delta R) führte zur Synzytien-Bildung. Die bildung hochfusogener Oberflächenhüllproteine durch die Abspaltung des R-Peptids konnte auch für andere gamma-Retroviren gezeigt werden. Die Synzytienbildung konnte quantitativ unter den Env delta R-Varianten verschiedener gamma-Retroviren in einem etablierten Fusionsassay verglichen werden. Das Env delta R des endogenen Retrovirus des Schweins (PERV) des Typs A erwies sich als potentestes Fusionsagens. Als Folge der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde postuliert, dass die Abspaltung des R-Peptides ein allgemeiner Mechanismus bei der Partikelreifung der gamma-Retroviren ist und eine fusionsregulierende Rolle besitzt. Eine Weiterentwicklung fusionsaktiver Env-Varianten als mögliche therapeutische Gene für eine Tumor-Gentherapie ist somit diskutierbar.
  • In-vivo modification of blood stem cells would be of a great advantage for a number of gene therapeutic approaches. The most important requirement for this is that retroviral vectors can be specifically targeted to the blood stem cells. A vector system derived from the avian spleen necrosis virus (SNV), where the receptor binding domain of the Env protein can be easily modified, lends itself for this so-called “cell targeting”. Within the scope of current work a SNV based retroviral cell targeting vector should be developed, which allows a selective gene transfer into the primary human CD34-positive hematopoietic cells. For the further characterization of the SNV derived vector system it should be clarified whether the Env protein of SNV exhibits so-called R-peptide, which is common for other gamma-retroviruses. Its possible role in the viral cell entry should be also examined. In order to achieve a cell specificity of the SNV vector, the entire CSU domain of the SNV Env protein was replaced with a single chain antibody fragment (scFv), which was directed against the CD34 molecule. Using such modified Env it was possible to create [(antiCD34-TM) SNV] vector particles, which specifically transduced CD34 positive cells. For the successful production of these vectors it was essential to establish a stable packing cell line, which produced vector particles with a titer of 2x105 i.u. per ml. In transduction experiments with different cell lines it was shown that [(antiCD34-TM) SNV] vectors possess a clear preference for CD34+ cells but not for CD34- cells. The difference in the transduction efficiency between CD34 positive and CD34 negative cells was nearly 100fold. [(antiCD34-TM) SNV] vectors were also able to transfer the reporter gene into the primary human stem cells. The protocol was optimized to enable the transduction of the CD34 positive cells isolated from the umbilical cord blood. The vector titer applied to these cells amounted up to 2x106 i.u. per ml. In a mixture of primary CD34+ and CD34- cells the developed vector could successfully distinguish between target and non-target cells. Not only the specificity of a SNV derived vector system, but also its selectivity was demonstrated for the first time. This result was a prerequisite for the further development of the vector to facilitate its in-vivo employment as a gene therapeutic agent. The second part of the current work was dedicated to the investigation of the fusion mechanism during the viral entry. The impetus was given by the observation that the cytoplasmic domain of SNV Env protein is proteolytically cleaved by the viral protease during the virus budding. A sequence comparison between SNV TM and MLV TM proteins gave a hint that this cleavage releases so-called R-peptide. This mechanism was already described for MLV. New SNV Env mutants with an accordingly shortened C-tail (Env delta R) were created. Their expression in the cultivated blood cells led to the formation of syncytia. Such inducing of fusion activity of surface capsid proteins by the cleavage of the R-peptide was shown also for other gamma-retroviruses. A fusion assay was established to compare quantitatively the activity of Env delta R variants of different gamma-retroviruses. The Env delta R of the porcine endogenous retrovirus type A (PERV A) was proved to be the most potent fusion agent. These results led to the assumption that the R-peptide cleavage is an essential step of the particle maturing of gamma-retroviruses and possesses a fusion-regulating role. It offers a possibility to develop highly active Env variants that could be advantageous for the tumor gene therapy.

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Metadaten
Author:Maria Bobkova
URN:urn:nbn:de:hebis:30-62388
Referee:Klaus Cichutek
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/02/03
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2008/12/02
Release Date:2009/02/03
Tag:Gentransfer; Paul-Ehrlich-Institut; R-Peptid; Retroviren; Stammzellen
R peptide; cell targeting; gene therapy; retrovirus; stem cells
GND Keyword:Gentherapie
HeBIS-PPN:208774734
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht