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Robyn Tewksbury

• Mesenchymal stem cells (MSC), also referred to as marrow stromal cells, maintain the capacity to differentiate into multiple mesenchymal lineages such as osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, myoblasts, stromal, neural and endothelial cells. The use of autologous MSC has generated widespread interest due to their developing application in regenerative medicine and tissue engineering in orthopedic surgery. They have become an indispensable cell source for successful implementation in many bone reconstruction procedures. In addition to their multipotency and selfrenewal capacity, they are easily harvested, have demonstrated a homing mechanism and can be efficiently expanded in vitro, thus providing a safe and costefficient tissue replacement for patients with skeletal injury or disease. Little information is currently available concerning donor characteristics for tissue engineering growth of osseous tissue. This study examines the influences of such donor characteristics, including injury pattern, gender, age, and site of harvest on the quantity, quality and osteogenic differentiation of MSC. The goal is to evaluate whether certain patient groups are practically suitable for an ex vivo expansion and therapeutic reimplantation of MSC. The effect of injury pattern on the reservoir and proliferative capacity of MSC in human bone marrow is clearly demonstrated in this analysis. Age and gender were also shown to influence MSC number and proliferation, as in previous studies. A total of 53 participants (46 patients and 7 healthy volunteers ranging from 18 to 64 years of age), who were scheduled to undergo operative procedures on the pelvis, vertebrae, tibia or hip as well as cancellous bone autografts for reconstruction of various bone defects, were included in the study. Participants were divided into 4 groups for each gender: single fracture, multiple trauma, atrophic nonunion and healthy volunteers. A minimum of 6 ml bone marrow samples were aspirated intraoperatively and processed immediately according to protocol. Following cultivation and expansion for 14 days, the cells were then stained for the colony forming unit-fibroblast (CFU-F) assay and each culture flask was photographed, digitized and converted to an 8 bit grey level TIF-format. Using the digitized CFU-F assay, the mean colony number, mean colony area and mean cell number per microscopic field of view (cell density) could be determined. In addition, confirmation of MSC phenotype was established using fluorescent activated cell sorting (FACS). MSC potential for osteogenic differentiation was quantified by von Kossa, alkaline phosphatase and alizarin staining. Furthermore, serum from a total of 39 randomly chosen participants was collected and tested for hormone levels of 17β-estradiol, testosterone and prolactin as well as the cytokine interleukin-6. These analyses demonstrate several significant trauma-related modifications in MSC reservoir and proliferation, in both male and female patients. In multiple trauma patients, the highest MSC frequency was found, independent of gender and age. Proliferative capacity was also highest in male multiple trauma patients. In the case of atrophic nonunion, the lowest MSC reservoir was detected, independent of gender. Furthermore, MSC frequency in male patients was significantly higher than in female, although analyses of hormone and interleukin-6 levels provided no correlation. Agerelated changes in MSC reservoir could also be observed, whereas the proliferative capacity produced only a tendency toward decreasing values with increasing age. Concerning the site of cell harvest, MSC isolated from the proximal extremity of the tibia, greater trochanter and vertebral body did not proliferate sufficiently enough to be included in statistical analysis, supporting the use of the iliac crest for efficient expansion of MSC. This data suggests the interaction of yet to be identified processes in bone marrow in multiple trauma situations which stimulate the activation and mobilization of MSC. Moreover, in the case of atrophic nonunion, the concentration in bone marrow is depleted and the absence of systemic stimulation present in multiple trauma results in reduced activation of proliferative capacity. Such patients, with severe injury or atrophic nonunion, represent a group of patients with an especially acute necessity for effective and successful bone reconstruction. This data can be used to determine the applicability of MSC from various patient groups for osseous tissue replacement procedures. Especially in such medically challenging situations, further research is essential not only to delineate the factors involved in MSC regulation but also to develop methods to stimulate MSC expansion and proliferation.
• Mesenchymale Stammzellen (MSC), auch als "marrow stromal cells" bezeichnet, besitzen die Kapazität zur Differenzierung in unterschiedliche Zellreihen wie Osteoblasten, Chondrozyten, Adipozyten, Myoblasten, Stromazellen, neurale Zellen und Endothellzellen. Der mögliche klinische Einsatz autologer MSC für die Gewebetechnik (tissue engineering) im Bereich der Wiederherstellungschirurgie, Traumatologie und Orthopädie ist mittlerweile das Thema von zahlreichen wissenschaftlichen und medizinischen Studien. Charakteristisch für MSC sind nicht nur Multipotenz und die Kapazität zur Selbsterneuerung, sie sind auch leicht isolierbar, besitzen einen Homing-Mechanismus und können effektiv in vitro expandiert werden. Dadurch stellen sie eine sichere und kosteneffiziente Option für Gewebsersatz für Patienten mit ossären Verletzungen oder Erkrankungen dar. Derzeit gibt es nur unzureichende Informationen bezüglich der Eigenschaften von MSC in Abhängigkeit des Spenders. Diese Arbeit untersucht den Einfluss von Spendereigenschaften wie Verletzungsmuster, Geschlecht, Alter und Entnahmestelle auf die Quantität, Qualität und osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen. Ziel der Evaluation ist Aufschluss zu geben, ob MSC bestimmter Patientengruppen überhaupt für eine ex vivo Expansion und anschließende therapeutische Reimplantation geeignet sind. Der signifikante Einfluss des Verletzungsmusters auf das Reservoir und die proliferative Kapazität von MSC im menschlichen Knochenmark wird in dieser Analyse eindeutig nachgewiesen. Analog zu früheren Studien korrelierten Alter und Geschlecht mit der MSC-Konzentration und –Proliferation. Insgesamt 53 Personen (46 Patienten und 7 gesunde Freiwilligen im Alter von 18 bis 64 Jahren) wurden in die Studie eingeschlossen. Die Knochenmarkpunktion erfolgte während einer ohnehin geplanten Operation an Beckenkamm, Wirbelsäule oder Tibia. Die Teilnehmer wurden gemäß ihres Verletzungsmusters in 4 Gruppen eingeteilt: Monofraktur, Polytrauma, Pseudarthrose und Kontrolle. Mindestens 6 ml Knochenmark wurden intraoperativ aspiriert und sofort nach einem Standardprotokoll verarbeitet. Nach 14 Tage Kultivation und Expansion wurden Zellen für den Colony Forming Unit-Fibroblast (CFU-F)-Test gefärbt und anschließend fotografiert, digitalisiert und in 8-Bit-Graustufen-TIF formatiert. Anhand der digitalisierten CFU-Assays konnten die mittlere Koloniezahl, Koloniegröße und Zellzahl pro Kolonie bestimmt werden. Der Phänotyp der kultivierten MSC wurde mittels Durchflusszytometrie bestätigt und das Potential zur osteogenen Differenzierung durch von Kossa-, Alkalische Phosphatase- und Alizarin-Färbung überprüft. Weiterhin wurde in Serumproben von insgesamt 39 zufällig ausgewählte Patienten 17β-Estradiol-, Testosteron-, Prolaktin und Interleukin-6 Spiegel bestimmt. Diese Arbeit zeigt bei Männer und Frauen multiple, signifikante, verletzungsbezogene Modifizierungen im MSC Reservoir und in der MSCProliferation. Polytraumen zeigten die höchste MSC-Konzentration im Knochenmark, unabhängig vom Geschlecht oder Alter. Die proliferative Kapazität war am höchsten bei männlichen Patienten mit Polytrauma. Bei Pseudarthrose konnte unabhängig vom Geschlecht die niedrigste MSC-Konzentration im Knochenmark festgestellt werden. Des Weiteren war die MSC Frequenz bei männlichen Patienten signifikant höher als bei weiblichen Patienten. Die Hormon- bzw der Interlekin-6-Spiegel korrelierten jedoch nicht mit den Stammzellparametern. Altersabhängige Veränderungen im MSC Reservoir wurden beobachtet, wobei die proliferative Kapazität nur eine Tendenz zu verminderten Werten mit zunehmendem Alter aufwies. Untersuchungen zum Einfluss der Entnahmestelle ergaben, dass MSC aus dem Tibiakopf oder Wirbelkörper nur ungenügend wachsen. Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass hauptsächlich MSC aus dem Knochenmark des Beckenkamms zur effizienten MSC Expansion geeignet sind. Die Ergebnisse weisen auf noch unklare Prozesse im Knochenmark hin, welche bei Polytrauma die Aktivierung und Mobilisierung von MSC stimulieren. Weiterhin ist bei Pseudarthrose die MSC-Konzentration im Knochenmark reduziert. In diesem Fall bewirkt wahrscheinlich die fehlende systemische Stimulation eine verminderte Aktivität. Besonders Patienten mit schweren Verletzungen oder Pseudarthrose haben höhere Risiken für Knochenheilungsstörungen und benötigen deshalb effektive und sichere Methoden zur Knochenrekonstruktion und gegebenenfalls für Knochenersatz. Für die zukünftige Verwendung von autologen ex vivo expandierten MSC geben diese Erkenntnisse Aufschluss, bei welchen Patientengruppen MSC eine ausreichende Qualität für eine therapeutische Anwendung aufweisen. Besonders für problematische Fälle sind weitere Studien notwendig, um die detaillierte Regulation von MSC zu untersuchen und Kultivierungs- und Expandierungsbedingungen zu verbessern.