Biochemical and biotechnological approaches as basis for structure determination of pigment-protein complexes of oxygenic photosynthesis

  • Today the structure of photosystem II, which is the enzyme responsible for the evolution of molecular oxygen by plants, algae and cyanobacteria, is known up to a resolution of about 3.0 Å in cyanobacteria (Loll et al., 2005). Photosystem II of higher plants, which shows some differences compared to the photosystem II of cyanobacteria, is not resolved in such high detail, yet (8-10 Å) (Rhee et al., 1998; Hankamer et al., 2001a). Therefore, the molecular structure of PSII of higher plants and its adjacent antenna complexes remains in the focus of the current research. One of the major problems when working with photosystem II is its relative instability during isolation. Together with the antenna proteins and several other proteins, some of which still have an unclear function, PSII forms a huge multi-protein-complex, which tends to fall apart during classical preparation methods. In order to achieve a faster and milder method of purification for PSII, four different His-tags have been added to one of the subunits of PSII. The gene targeted in this study is called psbE and codes for the α-chain of cytochrome b559, an integral part of PSII. The gene for PsbE is encoded in the chloroplast genome. The His-tags, which were employed in this work, consist of six or ten consecutive histidine aminoacid residues, which were fused to the N-terminus of the protein, either with or without a cleavage site for the protease “Factor Xa”. The N-terminus of PsbE is located on the more accessible stromal side of the thylakoid membrane. After inserting the psbE gene in a vector plasmid, in which the recognition site for the restriction endonuclease SacI had been eliminated, the different His-tags were generated by PCR with purposefully altered primers. In a final cloning step, a gene, which confers resistance to the antibiotics spectinomycin and streptomycin, was added to the DNA construct. Subsequently, the so-called biolistic transformation method (“gene gun”) was applied to introduce this genetically engineered plasmid DNA to Nicotiana tabacum chloroplasts (Bock & Hagemann, 2000). Through the processes of homologous recombination that take place in the chloroplast, the plastid encoded wildtype psbE gene was replaced by its His-tag containing counterparts. After several rounds of regenerating plants on antibiotic-containing medium, successful transformation was confirmed through PCR methods. By self fertilisation of fully regenerated plants, seeds were produced from tobacco strains, which carried only the mutated psbE gene. Plants cultivated from these seeds showed no distinctive phenotype under the chosen growth conditions, in respect to wildtype plants. The presence of the His-tag in this F1 generation was again confirmed with PCR methods. Measurements of oxygen evolution and pulse amplitude modulated fluorescence (PAM), carried out with preparations of wildtype and transgenic tobacco strains, revealed no differences for photochemical or non-photochemical quenching between both types. However, the oxygen evolution capacity of transgenic tobacco thylakoids compared to the wildtype was significantly reduced, although the chlorophyll content in relation to the leaf area was almost identical. This hints at a reduced amount of photosystem II complexes in the thylakoid membranes of transgenic tobacco. This alteration could be related to the mutation of cytochrome b559, because, amongst other functions, this subunit was shown to be important for the assembly of photosystem II (Morais et al., 1998). If solubilised thylakoid preparations of His-tagged plant strains were applied to a Ni-NTA column, photosystem II was selectively bound to the matrix. After washing away most of the contaminations, photosystem II core complexes could be eluted with imidazole-containing buffer. Photosystem II prepared in this way, displayed a drastic reduction of the peripheral light-harvesting complexes (LHCI & LHCII) and photo-system I reaction centres. This could be demonstrated by the loss of chlorophyll b and xanthophyll bands (LHCs) in absorption spectra, a small blue-shift of the chlorophyll a Qy absorption (PSI) and the respective band patterns in polyacrylamide gel electro-phoresis. The photosystem II complexes prepared in this way can now be put to use in different structural studies, like two-dimensional or three-dimensional crystallisation and spectroscopic measurements. Another photosynthetic pigment-protein complex of interest is the fucoxanthin-chlorophyll a/c-binding protein of diatoms, because eukaryotic algae, like diatoms, are important factors of oceanic ecosystems and account for a large part of marine biomass production. In order to facilitate ultra-fast time-resolved transient absorption spectroscopy and subsequent modelling of the kinetic traces, FCPs were prepared by sucrose-gradient ultra-centrifugation and their pigment stoichiometries determined by HPLC. Combining the spectroscopic data (Papagiannakis et al., 2005) with protein sequence alignments (Eppard & Rhiel, 1998) and the structure of the homologous higher plant LHCIIb (Kühlbrandt et al., 1994), a hypothetical model for the structure of FCP could be proposed (Fig. IV.3)
  • In höheren Pflanzen, Algen und Cyanobakterien ist das Photosystem II der Pigment-Protein-Komplex, der für die Freisetzung von molekularem Sauerstoff verantwortlich ist. Seine räumliche Struktur wurde kürzlich für Cyanobakterien mit einer Auflösung von circa 3,0 Ångstrom bestimmt (Loll et al., 2005). Das Photosystem II höherer Pflanzen, welches einige Unterschiede zu cyanobakteriellem PSII aufweist, konnte bisher nicht so detailliert aufgelöst werden (8-10 Å) (Rhee et al., 1998; Hankamer et al., 2001a). Aus diesem Grund stehen das Photosystem II höherer Pflanzen und die dazugehörigen Antennenkomplexe weiterhin im Mittelpunkt des Forschungsinteresses. Eines der größten Probleme bei der Arbeit mit Photosystem II ist seine relativ geringe Stabilität während des Aufreinigungsprozesses. Zusammen mit den Antennenkom-plexen und einigen anderen Proteinen, deren Funktion zum Teil noch nicht geklärt werden konnte, liegt Photosystem II als ausgedehnter Multiproteinkomplex in der Membran vor, der dazu neigt, während der Präparation einige seiner Untereinheiten zu verlieren. Um nun eine schnellere und schonendere Aufreinigung durchführen zu können, wurde eine Untereinheit von Photosystem II mit vier verschiedenen His-tags versehen. Das Gen, welches für die vorliegende Arbeit ausgewählt wurde, heißt psbE und kodiert für die α-Untereinheit des Cytochrom b559, welches einen integralen Be-standteil des Photosystems II darstellt. Das PsbE Protein ist im Chloroplastengenom kodiert. Die His-tags, die verwendet wurden, bestehen aus einer Folge von sechs beziehungsweise zehn Histidin-Aminosäureseitenketten, die an den N-Terminus des Proteins angehängt wurden, sowohl mit als auch ohne Spaltstelle für die Protease „Faktor Xa“. Der N-Terminus von PsbE befindet sich auf der leichter zugänglichen stromalen Seite der Thylakoidmembran. Um im weiteren Verlauf die Chloroplasten wie gewünscht transformieren zu können, mussten zunächst vier verschiedene Plasmid-DNA-Konstrukte erstellt werden, welche das jeweilige veränderte psbE Gen, sowie umfangreiche flankierende Sequenzbereiche und ein Resistenzgen beinhalteten. Die flankierenden Bereiche müssen dabei möglichst identisch zu den Sequenzabschnitten des Chloroplastengenoms sein, die während der Transformation ausgetauscht werden sollen, da dies die Austauschrate der entsprechenden DNA-Abschnitte durch die homologe Rekombinationsmaschinerie erhöht (Bock & Hagemann, 2000). Bevor das psbE Gen, das zusammen mit den flankierenden Sequenzen eine Länge von ~2300 bp aufweist, in den Plasmidvektor (~3.0 kbp) inseriert werden konnte, musste in diesem durch PCR mit gezielt veränderten Primern eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease SacI eliminiert werden, da es durch diese bei späteren Modifikationsschritten zu einer ungewollten Spaltung des Plasmids gekommen wäre. Die so entstandenen PCR-Produkte von ~3000 bp Länge, wurden mit Hilfe einer DNA Ligase wieder in ihre ringförmige Form gebracht, um in E. coli amplifiziert werden zu können. Sobald dies geschehen war und sich das psbE Gen in dem modifizierten Vektor befand, wurden wiederum durch PCR mit gezielt veränderten Primern die verschiedenen His-tags erzeugt. Die entstandenen PCR-Produkte wurden dann im Anschluss mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen (AgeI, SacI) zuge-schnitten und in das Vektorplasmid eingefügt. In einem letzten Klonierungsschritt wurde ein Gen, welches Resistenz gegenüber den Antibiotika Spectinomycin und Streptomycin verleiht, in die Sequenz eingefügt. Mit Hilfe der so genannten biolistischen Transformationsmethode („Genkanone“) wurden schließlich die fertigen DNA-Konstrukte in Chloroplasten von Nicotiana tabacum eingebracht (Bock & Hagemann, 2000). Durch die homologen Rekombinationsprozesse, die in den Chloro-plasten ablaufen, wurde das Wildtyp psbE Gen durch sein His-tag tragendes Gegen-stück ersetzt. Nach mehreren Runden der Regeneration und Selektion der Pflanzen auf Anti-biotikum enthaltendem Medium, wurde die erfolgreiche Transformation mit Hilfe von PCR-Methoden überprüft. Aus den Tabaklinien, die nur noch Chloroplasten mit dem mutierten psbE Gen besaßen, die also homoplasmisch waren, wurden Samen hergestellt, indem vollständig regenerierte Pflanzen mit ihren eigenen Pollen befruchtet wurden. Die verschiedenen transgenen Tabaklinien, die mit Hilfe dieser Samen angezogen wurden, zeigten unter den gewählten Anzuchtsbedingungen (25°C, 8 h Licht, 100–150 μE/(s·m2), 16 h Dunkelheit, 50 % relative Luftfeuchtigkeit) keinerlei auffällige phänotypische Abweichung gegenüber den Wildtyppflanzen. Das Vorhan-densein des His-tags in der entstandenen F1 Generation wurde anschließend erneut durch PCR überprüft. ....

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Metadaten
Author:Holger Fey
URN:urn:nbn:de:hebis:30-67719
Referee:Claudia Büchel
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2009/07/10
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/12/07
Release Date:2009/07/10
GND Keyword:Photosynthese; Oxygenierung; Pigmentproteine; Strukturaufklärung; Biochemie; Biotechnologie
HeBIS-PPN:21458643X
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht