Analyse der Wirkmechanismen verschiedener NADPH-Oxidase-Hemmstoffe

  • Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
  • A large body of literature suggest that vascular NADPH oxidases are important sources of reactive oxygen species (ROS). Many studies however relied on data obtained with the inhibitor apocynin (4’-hydroxy-3’-methoxyacetophenone). As the mode of action of apocynin, however, is elusive, we determined its mechanism of inhibition on vascular NADPH oxidases and looked for other inhibitors of NADPH oxidases. In HEK293 cells overexpressing NADPH oxidase isoforms (Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 or Duox2), apocynin failed to inhibit superoxide anion generation detected by lucigenin chemiluminescence. In contrast, apocynin interfered with the detection of ROS in assay systems selective for hydrogen peroxide or hydroxyl radicals. Importantly, apocynin interfered directly with the detection of peroxides but not superoxide, if generated by anthine/xanthine oxidase or non-enzymatic systems. In leukocytes, apocynin is a prodrug which is activated by myeloperoxidase (MPO), a process which results in the formation of apocyninradicals and than apocynindimers. Endothelial cells and smooth muscle cells failed to form these dimers and therefore are not able to activate apocynin. Dimer formation was however observed in Nox-overexpressing HEK293 cells when MPO was supplemented. As a consequence apocynin should only inhibit NADPH oxidase in leukocytes whereas in vascular cells, the compound could act as an antioxidant. Indeed, in vascular smooth muscle cells, the activation of the redox-sensitive kinases p38-MAP-kinase, Akt and Erk1/2 by hydrogen peroxide and by the intracellular radical generator menadione was prevented in the presence of apocynin. We next tested whether cyclooxygenase2 (Cox2), which contains a peroxidase domain similar to that of MPO, interacts with apocynin. Indeed the activity of Cox2 was reduced by apocynin in a dose dependent manner. In HEK293 cells overexpressing Cox2, superoxide anion as well as hydrogen peroxide generation was detected by lucigenin chemiluminescence and luminol chemiluminescence respectively. The Cox2-dependent ROS generation was completely inhibited by apocynin. But Cox2 can’t activate apocynin, no dimer formation was detected. This observation further supports the unspecific nature of the Nox inhibition elicited by apocynin.Apocynin, when applied intravenously was activated in mice and in pig and acted as specific Nox2 inhibitor. Flavonoids, particularly those of the catechol-type in which the B-ring is monomethylated have a structure similar to that of apocynin. We therefore analysed the potential of different flavonoids (epicatechine, 3´-o-methylepicatechine, procyanidin B2 and isorhamnetin) as inhibitors of the NADPH oxidase. In HEK293 cells overexpressing NADPH oxidase isoforms (Nox1, Nox2 or Nox4), ROS generation was detected by chemiluminescence. Epicatechine and procyanidin B2 completely blocked the detectable level of radical production by the various Nox isoforms. Isorhamnetin slightly inhibited the radical detection of ROS generated by Nox1, detection of ROS formed by Nox4 and Nox2 was blocked completely. Finally, we tested 3'-o-methyl-epicatechine. This compound has the weakest antioxidative effects, but is most similar to apocynin. In the presence of 3'-o-methyl-epicatechine hydrogen peroxide detection was blocked but detection of superoxide generated by Nox1 and Nox2 remained unaffected. None of the testet compounds blocked the respiratory burst in phorbolmyristatacetate stimulated leukocytes. These data suggest that apocynin and flavonoids are potent antioxidants in vascular systems but not NADPH oxidase inhibitors.

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Metadaten
Author:Sabine Heumüller
URN:urn:nbn:de:hebis:30-71075
Referee:Anna Starzinski-Powitz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/09/28
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/07/17
Release Date:2009/09/28
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:417689160
Institutes:Biowissenschaften / Biowissenschaften
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
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