Quantifizierung der Expression der NADPH-Oxidasen mittels real-time RT-PCR

  • Ziel dieser Arbeit war die Quantifizierung der Expression der NADPH-Oxidase-Isoformen in verschiedenen Organen der Maus sowie Zellkulturen aus HUVEC und VSMC von Maus, Ratte und Mensch mittels real-time RT-PCR. Darüberhinaus wurde der Einfluss von für die Pathophysiologie der Atherosklerose bedeutsamen Wachstumsfaktoren auf die Expression verschiedener NADPH-Oxidase-Untereinheiten in Gefäßmuskelzellen sowie die Bedeutung von Nox2 für die endotheliale Dysfunktion in einem Maus-Modell für renovaskuläre Hypertonie untersucht. Nox1 und Nox4 konnten bemerkenswerterweise in fast allen untersuchten Proben nachgewiesen werden, wobei sich große quantitative Unterschiede zwischen den verschiedenen Organen fanden. Für Nox1 und Nox4 betrugen diese Unterschiede bis zu drei Zehnerpotenzen, für Nox2-mRNA bis zu zwei Zehnerpotenzen. Sortiert man die verschiedenen Organe nach der Stärke ihrer Nox-Expression gilt rur Nox1 Colon> Milz> Niere> Aorta, für Nox2 Milz> Niere = Aorta> Colon und für Nox4 Niere> Milz> Colon> Aorta. Im der Aorta werden gleichzeitig drei verschiedene NADPH-Oxidase-Isoformen exprimiert: Nox1, Nox2 und Nox4. Das individuelle Expressionsmuster von Nox1, Nox2 und Nox4 in der Aorta variierte zwischen einzelnen Tieren zum Teil beträchtlich. Insbesondere Endothelzellen exprimieren alle drei Nox-Isoformen, während VSMC der Aorta nur Nox1 und Nox4 und Fibroblasten der aortalen Adventitia v. a. Nox2 exprimieren. Die in nicht-phagozytären Zellen exprimierten NADPH-Oxidasen unterscheiden sich von der Phagozyten-NADPH-Oxidase nicht nur in der maximalen ROS-Produktionskapazität und der intrazellulären Lokalisation, sondern auch in der Zusammensetzung des Enzymkomplexes aus den verschiedenen Untereinheiten. Sortiert man die verschiedenen Organe wiederum nach der Stärke der Expression der verschiedenen Untereinheiten ergibt sich für p67phox, Noxa1 und Noxo1 die gleiche Reihenfolge, Colon > Aorta > Niere. Die quantitativen Expressionsunterschiede betragen dabei für p67phox nur eine Zehnerpotenz, für Noxal drei Zehnerpotenzen und rur Noxol zwei Zehnerpotenzen. Die quantitative Untersuchung der Expression der Aktivatoruntereinheiten der NADPH-Oxidase in vaskulären Zellen ergab eine stärkere Noxa1-Expression in HUVEC als in VSMC während letztere mehr p67phox exprimieren als HUVEC. Überraschenderweise exprimierten menschliche VSMC der Aorta um ein Vielfaches mehr p67phox als murine VSMC der Aorta, während die quantitative Noxa1- und Noxo1-Expression in menschlichen und murinen, VSMC keine derart großen Unterschiede zeigten. Wahrscheinlich sind diese Expressionsunterschiede der NADPH-Oxidase-Untereinheiten Teil einer bedarfs- und situationsgerechten, zelltypspezifischen Regulation der Sauerstoffradikalproduktion durch die NADPH-Oxidase. So zeigt sich zum Beispiel in VSMC unter Stimulation mit PDGF ein Anstieg der p67phox-Expression und eine Reduktion der NoxalExpression, während Angiotensin II keinen signifikanten Effekt auf die Noxa1-Expression hat. PDGF, ein proliferationsfördernder Faktor für VSMC, unterstützt auf diese Weise eine durch Proteinkinase C-regulierte Aktivität der NADPH-Oxidase. Angiotensin II, das v. a. die Hypertrophie glatter Gefäßmuske1zellen induziert, fördert dagegen die Noxal-Expression, was eher für eine konstitutive NADPH-Oxidase-Aktivität förderlich ist. Anhand der hier gezeigten quantitativen Expressionsuntersuchungen lassen sich leider allenfalls Spekulationen über die möglichen Regulationsmechanismen der ROS-Produktion in VSMC anstrengen. Dennoch haben sich mit Hilfe der in dieser Arbeit gesammelten Ergebnisse, ähnlich einem Puzzle, dem großen Bild der NADPH-Oxidasen und ihrer Regulation ein paar kleine Teilchen hinzugefügt. An einem 2-Nieren-1-Clip-Modell für renovaskuläre Hypertonie wurde der Einfluss der NADPH-Oxidase-Aktivität und Expression auf die endotheliale Dysfunktion untersucht. In Aortenringen von geclippten Wildtyp-Mäusen kommt es zu einer erhöhten Elimination exogen zugeführten NOs sowie gestörter endothelvermittelter Relaxation der Gefäßmuskulatur auf Acetylcholin, was auch als endotheliale Dysfunktion bezeichnet werden kann. Die durch den Clip verursachte endotheliale Dysfunktion wird durch Entfernen des Endothels aus den untersuchten Gefäßabschnitten oder Elimination des Nox2-Gens aus dem Genom der Mäuse verhindert. Damit zeigt diese Untersuchung, dass die endotheliale Dysfunktion bei der renalen Hypertonie in Mäusen durch die Aktivierung der endothelialen NADPH-Oxidase verursacht wird. Die Erkenntnisse dieser Arbeit demonstrieren daher ein mögliches therapeutisches Potential von Isoform-spezifischen-NADPH-Oxidase-Hemmstoffen als wirksame Medikamente in der Behandlung vaskulärer Dysfunktionen, wie sie z. B. bei der renovaskulären Hypertonie vorkommen. Unabdingbare Vorraussetzung dafiir sind jedoch detailliertere Kenntnisse der komplexen Mechanismen der NADPH-Oxidase-Regulation im Gefßsystem.
  • Gene expression of severa1 NADPH-oxidase isoforms was analyzed in different organ systems of the-mouse as well as cell cultures of VSMC and endothelial cells of murine, human or rat origin by real-time RT-PCR. Furthermore, the effect of atherogenic growth factors such as angiotensin 11 on the expression levels of several NADPH-oxidase subunits was characterized. The importance of Nox2 regarding endothelial dysfunetion was additionally investigated in a mouse model for renovascular hypertension. Remarkably, Nox1 and Nox4 were found in almost all sampies tested. There were big quantitative differences, however, in the rate of expression in distinct organs. These differences measured up to three decimal powers in case of Nox1 and Nox4 and two decimal powers in case of Nox2-mRNA. Sorting the examined organs according to their rate of expression results in the following descending orders: In case of Nox1 applies colon> spleen > kidney > aorta, in case of Nox2 applies spleen> kidney = aorta > colon, and in case of Nox4 applies kidney > spleen> colon> aorta. In the aorta, there is coinstantaneous expression of Noxl, Nox2 and Nox4, partly with considerable variation in the isoforms' expression rate between individuals. In particular, endothelial cells express all three Nox-isoforms, whereas VSMC merely express Noxl and Nox4 and adventitial fibroblast predominantly express Nox2. NADPH oxidase forms of non-phagozytic cells differ from the phagozyte type NADPH oxidase not only in their maximum ROS production capacity and intracellular localization but also in the subunit composition of their enzyme complex. Sorting the different organs a new according to their rate of subunit expression, the same descending order applies for p67phox, Noxa1 and Noxo1: colon> aorta > kidney. The quantitative expression rate differences between organs measure in case ofp67phox one decimal power, of Noxo1 two decimal powers and of Noxa1 three decimal powers. The quantitative expression analysis of the NADPH oxidase activator subunits in vascular cells yielded a predominant Noxal expression in HUVEC compared to p67phox, and oppositely, a stronger expression of p67phox than Noxa1 in VSMC. Surprisingly, human aorta VSMC express p67phox to a much greater extend than murine aorta VSMC. By contrast, there is no big difference conceming the quantitative expression rate ofNoxal and Noxol between human and murine VSMC. These differences in expression of NADPH oxidase subunits are probably due to cell type specific regulation adapting the amount of oxygen radica1 generation to situational and environmental conditions. In VSMC for example, there is a rise in p67phox expression and decrease of Noxa1 expression under stimulation by PDGF, while angiotensin II has no significant influence on Noxa1 expression. In this way, the proliferation enhancing factor PDGF supports protein kinase C dependent activity ofthe NADPH oxidase in VSMC. On the contrary, angiotensin II which, as a hypertrophy inducing factor for VSMC, enhances Noxa1 expression and thereby rather supports constitutive activity of NADPH oxidase. By means of the quantitative analysis of differences in NADPH oxidase expression demonstrated here, one can unfortunately at the most speculate about possible regulatory mechanisms of ROS production in VSMC. By means of the results collected in this work, however, a couple of pieces have been added to the puzzle of knowledge about NADPH oxidases and their manner of regulation. The influence of NADPH oxidase gene expression and activity on renovascular hypertension was investigated in a 2-kidney-one-clip-model. Clipping one renal artery of wild typ mice leeds to increased elimination of exogenous administered NO as well as impared endothelial-dependant relaxation of the vascular musculature to acetylcholine in aortic rings, also referred to as endothelial dysfunction. Endothelial dysfunction induced by the clip application can be prevented by removal of the endothelial layer of the aortic rings or alternatively by knocking out the Nox2 gene of the mouse genome. Hence, this study shows that endothelial dysfunction in renovascular hypertension in mice is caused by activation of the endothelial NADPH oxidase. Tbe findings of this work point out the potential therapeutic capability of isoforrn specific NADPH oxidase inhibitors as effective drngs in the treatment ofvascular dysfunctions as for example in renovascular hypertension. Yet, more detailed knowledge of the complicated mechanisms of the NADPH oxidase regulation in the vascular system is an indispensable prerequisite for this objective in the future.

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Metadaten
Author:Judith G. Schreiber
URN:urn:nbn:de:hebis:30-71786
Referee:Ralf Peter Louis BrandesORCiDGND, Alexandra Aicher
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2007
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2007/11/26
Release Date:2009/10/19
Page Number:91
HeBIS-PPN:218657412
Institutes:Medizin / Medizin
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht