The dual role of the chemokine fractalkine in platelet activation and adhesion to von Willebrand factor under physiologic flow conditions

  • The aim of the study was to investigate the role of the CX3C chemokine FKN in the role of platelet adhesion. The presence of the FKN receptor CX3CR1 in platelets is demonstrated and G-protein dependent activation of platelets with soluble FKN results in the increased adhesion of platelets to collagen and fibrinogen under flow 228 and adhesion of leucocytes to firmly attached platelets 231. Whether membrane-bound FKN is capable to promote the direct adhesion of platelets in flowing blood analogue to leucocytes was completely unknown. The adhesion mechanisms of FKN in mediating the adhesion of leucocytes under flow are well characterised and represent a novel unique mechanism of leucocyte capture and firm adhesion: FKN is responsible for immediate arrest of flowing CX3CR1 expressing leucocytes without the participation of additional adhesion receptors and ligands. This is in contrast to the classical leucocyte adhesion pathways, which are multistep processes involving leucocyte arrest, rolling and subsequent cell activation prior to firm arrest. In leucocytes, the FKN – CX3CR1 axis is sufficient to allow rapid arrest of leucocytes at low shear flow conditions 67, 101, 115, 122, 261. The set of data from this study demonstrates that immobilised FKN was capable to mediate the adhesion of platelets under low shear conditions, whereas there was no interaction in the absence of shear flow. In the presence of vWf in the adhesion matrix, FKN mediated the potent increased adhesion of platelets. This was in parts due to the activation of flowing platelets via CX3CR1 and the augmented translocation of platelets on FKN via the vWf receptor GPIbα. With respect to platelet activation, the function of endothelial FKN was comparable to leucocytes: in both cell types, the FKN dependent activation is mediated by its cognate receptor CX3CR1. This is in contrast to the adhesive capacity: in leucocytes, FKN dependent adhesion is mediated by CX3CR1, whereas in platelets, the adhesive capacity was mostly mediated by the vWf receptor GPIbα with only minor contribution from CX3CR1. In platelets, activation and adhesion by FKN were mediated by two distinct receptors, whereas in leucocytes, CX3CR1 is solely responsible for FKN dependent activation and adhesion. The presented results point out to a role of platelets in early stage of atherosclerosis. The in vivo expression of both, FKN and vWf is regulated by TNF-α, which is released in early stages of inflammation. The presence of vWf and FKN in the endothelial lining of blood vessels during these conditions is sufficient to initiate the capturing and translocation of platelets on the tunica interna. The rolling of platelets on the endothelium can induce endothelial damage and inflammation of the vessel, which might advance to the generation of clinically significant atherosclerotic plaques and fibrous atheroma.
  • Das CX3C Chemokin Fractalkin (FKN) vermittelt die rapide Adhäsion von Leukozyten via dem FKN Rezeptor CX3CR1. Neben diversen Subtypen von Leukozyten wird CX3CR1 auch in Thrombozyten exprimiert und eine Stimulation humaner Thrombozyten mit löslichem FKN erhöht die Adhäsion an Fibrinogen und Collagen unter physiologischen Flußbedingungen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klärung der Frage, ob immobilisertes FKN, wie es vom aktiviertem Endothel exprimiert wird, eine direkte Adhäsionskompetenz neben seiner Rolle als Thrombozytenaktivator besitzt. Unter statischen Bedingungen konnte keine Adhäsion von Thrombozyten an FKN nachgewiesen werden, während Fibrinogen eine starke Adhäsion vermittelte. Ein Flusskammer Modell wurde etabliert, um die Adhäsion unter physiologischen Flussbedingungen zu untersuchen. Immobilisiertes FKN konnte Thrombozyten bis zu einer Wandscherrate von 150 s-1 aus fließendem Blut einfangen und eine feste Adhäsion vermitteln, ohne dass weitere Adhäsionsliganden vorhanden waren. Dieser Effekt war schwach und gering über den Niveau der unspezifischen Adhäsion von Thrombozyten auf BSA Kontroll-Oberflächen. Eine Ko-Immobilisation von FKN mit von Willebrand Faktor (vWf) bewirkte eine Verdoppelung der adhärenten Thrombozyten bei einer Scherrate von 150 s-1 und 600 s-1 gegenüber µ-slides, die mit vWf alleine beschichtet wurden. Immobilisiertes FKN in einer vWf Matrix bewirkte somit eine starke Zunahme der Zahl an fest adhärenten Thrombozyten, welche quantitativ deutlich größer war als die Adhäsion, welche durch FKN alleine verursacht wurden. Die zusätzliche Adhäsion, die durch FKN vermittelt wurde, war somit überadditiv und legte nahe, dass der FKN Rezeptor CX3CR1 nicht alleine für die vermehrte Adhäsion an vWf verantwortlich war. Um die beteiligten Rezeptorsysteme und eventuelle Aktivierung der Thrombozyten während des Rollens auf FKN und vWf zu untersuchen, wurden gewaschenen Thrombozyten mit spezifischen Inhibitoren vor der Rekombination mit den autologen Erythrozyten zum rekonstituierten Blut inkubiert. Nach der Prä-Inkubation mit einem blockierenden CX3CR1 Antikörper sank die Rate der Thrombozyten Adhäsion auf das Niveau der vWf Oberflächen. Die vermehrte Adhäsion durch FKN beruhte somit, wie erwartet, auf einer spezifischen Interaktion zwischen FKN und CX3CR1. Diese Interaktion aktivierte durch G-Protein abhängige Signaltransduktion den GPIIb/IIIa Rezeptor, da sowohl Abxicimab als auch PTX die Adhäsion auf das Niveau von vWf alleine absenken. Interessanterweise bewirkte eine Inhibition des GPIb? auch eine Hemmung der FKN vermittelten verstärkten Adhäsion an vWf. Anschließend wurde die Zahl der translozierenden Thrombozyten auf FKN ko-immobilisiert mit vWf gemessen. Die Anwesenheit von FKN in der vWf Adhäsionsmatrix bewirkte eine Verdoppelung der Zahl der rollenden Thrombozyten verglichen mit µ-slides, welche mit vWf alleine beschichtet wurden. Unerwarteterweise wurde dieser Effekt nicht durch den FKN Rezeptor CX3CR1 vermittelt, sondern konnte nur durch Prä-Inkubation der Thrombozyten mit einem blockierenden anti-GPIb? Antikörper unterbunden werden. Um die Hypothese einer möglichen Interaktion FKN – GPIb? unter Fluss zu überprüfen, wurde der extrazelluläre Teil von GPIb?, genannt Glycocalicin, isoliert und kovalent an fluoreszente Mikrokugeln mit dem Durchmesser eines durchschnittlichen Thrombozyten gekoppelt und im rekonstituiertem Blut über FKN, vWf und FKN ko-immobilisiert mit vWf perfundiert. Glycocalicin interagierte mit immobilisiertem FKN bei den Scherraten 150 s-1 und 600 s-1 signifikant über dem Niveau der unspezifischen Adhäsion. Diese Interaktion ließ sich durch Prä-Inkubation der Mikrokugeln mit dem blockierenden anti-GPIb? Antikörper verhindern, was eine spezifische Interaktion des Chemokins FKN mit dem vWf Rezeptor GPIb? zeigt. Die Mikrokugeln interagierten mit vWf bei allen untersuchten Scherraten 150 s-1 bis 1800 s-1 und die Zahl der interagierenden Mikrokugeln war verdoppelt, wenn FKN in der vWf Adhäsionsmatrix vorhanden war. Kontroll-Mikrokugeln, welche mit BSA beschichtet wurden, interagierten nicht nennenswert mit der vWf oder FKN plus vWf Oberfläche. Endotheliales FKN interagierte somit zwei verschiedenen Thrombozyten Rezeptoren: CX3CR1 und GPIb?. Dies stellt einen markanten Unterschied zur FKN Funktion in Leukozyten dar: in Leukozyten übt FKN sowohl die Adhäsion als auch die Aktivierung via den FKN Rezeptor CX3CR1 aus, aber in Thrombozyten wird die Aktivierung durch den FKN Rezeptor CX3CR1 vermittelt, während die Thrombozyten Adhäsion vorwiegend durch den vWf Rezeptor GPIb? initiiert wird. Daneben ist Bindung von FKN an CX3CR1 zu einer schwachen direkten Adhäsion von Thrombozyten bei einer Scherrate von 150 s-1 fähig. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine Rolle der Thrombozyten in den frühen Stadien der Arteriosklerose hin, Zustände, die mit einer hohen FKN und vWf Expression im Endothel einhergehen.

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Metadaten
Author:Sascha Meyer dos Santos
URN:urn:nbn:de:hebis:30-73170
Referee:Walter E. Müller
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2009/12/28
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/12/01
Release Date:2009/12/28
Note:
Diese Dissertation steht leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext im WWW zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:419588442
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Sammlung Biologie / Weitere biologische Literatur (eingeschränkter Zugriff)
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