Open Access

Katharina Maria Lückerath

• Fas Ligand (FasL; CD95L; CD178; TNSF6) is a 40 kDa glycosylated type II transmembrane protein with 279 aa in mice and 281 aa in humans that belongs to the tumor necrosis factor (TNF) family. The extracellular domain (ECD) harbors a TNF homology domain, the receptor binding site, a motif for self assembly and trimerization, and several putative N-glycosylation and a metalloprotease cleavage site/s. The cytoplasmic tail of FasL is the longest of all TNFL family members and contains several conserved signaling motifs, such as a putative tandem Casein kinase I phosphorylation site, a unique proline-rich domain (PRD) and phosphorylatable tyrosine residues (Y7 in mice; Y7, Y9, Y13 in human). The FasL/Fas system is renowned for the potent induction of apoptosis in the receptor-bearing cell and is especially important for immune system functions. It is involved in the killing of target cells by natural killer (NK) and cytotoxic T cells, in the (self) elimination of effector cells following the proliferative phase of an immune response (activation-induced cell death; AICD), in the maintenance of immuneprivileged sites and in the induction and maintenance of peripheral tolerance. Owing to its potent pro-apoptotic signaling capacity and important functions, FasL expression and activity are tightly regulated at transcriptional and posttranscriptional levels and restricted to few cell types, such as immune effector cells and cells of immune-privileged sites. In contrast, Fas is expressed in a variety of tissues including lymphoid tissues, liver, heart, kidney, pancreas, brain and ovary. In addition to its pro-apoptotic function, the FasL/Fas system can also elicit nonapoptotic signals in the receptor-expressing cell. Among others, Fas-signaling exerts co-stimulatory functions in the immune system, e.g. by promoting survival, activation and proliferation of T cells. Besides the capacity to deliver a signal into receptor-bearing cells (‘forward signal’), FasL can receive and transmit signals into the ligand-expressing cell. This phenomenon has been described for several TNF family ligands and is known as ‘reverse signaling’. The first evidence for the existence of reverse signaling into FasL-bearing cells stems from two studies that demonstrated either co-stimulation of murine CD8+ T cell lines by FasL cross-linking or inhibition of activation-induced proliferation of murine CD4+ T cells. In both cases, the observed changes of proliferative behaviour critically depended on the presence of a signaling-competent FasL. Almost certainly, the FasL ICD is functionally involved in signal-transmission: (i) The ICD is highly conserved across species and harbors several signaling motifs, most notably a unique PRD. (ii) Numerous proteins have been identified which interact with the FasL PRD via their SH3 or WW domains and regulate various aspects of FasL biology, such as FasL sorting, storage, cell surface expression and the linkage of FasL to intracellular signaling pathways. (iii) Post-translational modifications of the ICD have been implicated in the sorting of FasL to vesicles and the FasL-dependent activation of Nuclear factor of activated T cells (NFAT). (iv) Proteolytic processing of FasL liberates the ICD and allows its translocation into the nucleus where it might influence gene transcription. (v) It could be shown that overexpression of the FasL ICD is sufficient to initiate reverse signaling upon concomitant T cell receptor (TCR) stimulation and ICD cross-linking. Conflicting data on the consequences of FasL reverse signaling exist, and costimulatory as well as inhibitory functions have been reported. These discrepancies probably reflect the use of artificial experimental systems. Neither the precise molecular mechanism underlying FasL reverse signaling, nor its physiological relevance have been addressed at the endogenous protein level in vivo. Therefore, a ‘knockout/knockin’ mouse model in which wildtype FasL was replaced with a deletion mutant lacking the intracellular portion (FasL Delta Intra) was established in the group of PD Dr. Martin Zörnig. In the present study, FasL Delta Intra mice were phenotypically characterized and were employed to investigate the physiological consequences of FasL reverse signaling at the molecular and cellular level. To ensure that FasL Delta Intra mice represent a suitable model to study the consequences of FasL reverse signaling, we demonstrated that activated lymphocytes from homozygous FasL Delta Intra or wildtype mice express comparable amounts of (truncated) FasL at the cell surface. The truncated protein retains the capacity to induce apoptosis in Fas receptor-positive target cells, as co-culture assays with FasL-expressing activated lymphocytes and Fas-sensitive target cells showed. Additionally, systematic screening of unchallenged mice did not reveal any phenotypic abnormalities. Notably, signs of a lymphoproliferative autoimmune disease associated with FasL-deficiency could not be detected. As several reports have implicated FasL reverse signaling in the regulation of T cell expansion and activation, proliferation of lymphocytes isolated from FasL Delta Intra and wildtype mice in response to antigen receptor stimulation was investigated. Using CFSE dilution assays it could be demonstrated that the proliferative response of CD4+ T cells, CD8+ T cells and of B cells was enhanced in the absence of the FasL ICD. Interestingly, this effect was most pronounced in B cells and could only be detected in CD4+ T cells after depletion of CD4+CD25+ regulatory T cells. To our Summary knowledge, this is the first time that FasL reverse signaling has been demonstrated in B cells. In a series of experiments, the activation of several pathways that are known to play important roles in signal-transmission initiated upon antigen receptor triggering was assessed. As a molecular correlate for the observed enhancement of activation-induced proliferation, Extracellular signal regulated kinase (ERK1/2) phosphorylation was significantly increased in FasL Delta Intra mice following antigen receptor crosslinking. Surprisingly, B cell stimulation lead to a comparable extent of activating phosphorylations on S38 in c-Raf and S218/S222 in MEK1/2 in cells isolated from wildtype and FasL Delta Intra mice, indicating that Mitogen activated protein kinases (MAPKs) upstream of ERK1/2 (Raf-1 and MEK1/2) apparently do not contribute to the differential regulation of ERK1/2. Experiments in which activation-induced Akt phosphorylation (S473) was quantified also did not suggest a participation of Phosphoinositol specific kinase 3 (PI3K)/Akt signals in this process. Instead, further characterization of the upstream pathway revealed an involvement of Phospholipase C gamma (PLC gamma) and Protein kinase C (PKC) signals in FasL-dependent ERK1/2- regulation. Previous studies in our group revealed a Notch-like processing of FasL, resulting in the transcriptional regulation of a reporter gene. Furthermore, an interaction of the FasL ICD with the transcription factor Lymphoid-enhancer binding factor-1 (Lef-1) that affected Lef-1-dependent reporter gene transcription could be demonstrated. Therefore, a molecular analysis of activated lymphocytes was performed to identify FasL reverse signaling target genes. The differential expression of promising candidates was verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR), which showed that the transcription of genes associated with lymphocyte proliferation and activation was increased in FasL Delta Intra mice compared to wildtype mice. Interestingly, an extensive regulation of Lef-1-dependent Wnt/beta-Catenin signalingrelated genes was found. Lef-1 mRNA (RT-PCR) and protein (intracellular FACS staining) could be detected in mature B cells, suggesting the possibility of FasL ICD-mediated inhibition of Lef-1-dependent gene expression in these cells, initiated by Notch-like processing of FasL. To investigate the consequences of FasL reverse signaling in vivo, a potential participation of the FasL ICD in the regulation of immune responses upon various challenges was analyzed. In experiments in which thymocyte proliferation or the expansion of antigen-specific T cells following a challenge with the superantigen Staphylococcus enterotoxin B (SEB), with Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) or with Listeria monocytogenes were investigated, comparable results were obtained with wildtype and FasL Delta Intra mice. Likewise, the recruitment of neutrophils in a thioglycollate-induced model of peritonitis was not affected by deletion of the FasL ICD. These findings might reflect regulatory mechanisms operating in vivo, such as control exerted by regulatory T cells. Along these lines, proliferative differences in CD4+ T cells could only be detected ex vivo after depletion of CD4+CD25+ regulatory T cells. Furthermore, several in vitro studies indicate that retrograde FasL signals can be observed under conditions of suboptimal lymphocyte stimulation, but not when the TCR is optimally stimulated. Therefore, the potent initiation of antigen receptor signaling by stimuli like SEB or LCMV might have masked inhibitory FasL reverse signaling in these experiments. In agreement with the observed hyperactivation of lymphocytes in the absence of the ICD ex vivo, the increase in germinal center B cells (GCs) following immunization with the hapten 3-hydroxy 4-nitrophenylacetyl (NP) and the number of antibody-secreting PCs was significantly higher in FasL Delta Intra mice. The larger quantity of PCs correlated with increased titers of NP-binding, i.e. antigen-specific, IgM and IgG1 antibodies in the serum of FasL Delta Intra mice after immunization. These data suggest that FasL reverse signaling exerts immunmodulatory functions. Supporting this notion, a model of Ovalbumin-induced allergic airway inflammation revealed an involvement of retrograde FasL-signals in the recruitment of immune effector cells into the lung and in the activation of T cells following exposure of mice to Ovalbumin. Together, our ex vivo and in vivo findings based on endogenous FasL protein levels demonstrate that FasL ICD-mediated reverse signaling is a negative modulator of certain immune responses. It is tempting to speculate that FasL reverse signaling might be a fine-tuning mechanism to prevent autoimmune diseases, a theory which will be tested in adequate mouse models in the future.
• Der Fas Ligand (FasL; CD95L; CD178; TNSF6) ist ein glykosyliertes Typ II Transmembranprotein, das zur Proteinfamilie der Tumornekrosefaktor (TNF)-Liganden gehört. Das Mausprotein besteht aus 279 Aminosäuren, während der humane FasL 281 Aminosäuren umfasst. Im extrazellulären Teil des Liganden befinden sich eine TNF Homologie-Domäne, die Rezeptorbindestelle, ein Sequenzmotiv zur Selbstaggregation und Trimerisierung sowie mehrere Stellen, an denen der FasL N-glykosyliert oder von Metalloproteasen geschnitten werden kann. Die intrazelluläre Region des FasL ist die längste aller TNFL-Familienmitglieder und enthält verschiedene konservierte Signalmotive, z.B. ein Casein-Kinase I (CK-I) Substrat-Motiv, eine Prolin-reiche Domäne (PRD) und potentielle Tyrosin-Phosphorylierungsstellen (Maus: Y7; Mensch: Y7, Y9, Y13). Die Bindung des FasL an den zugehörigen Rezeptor Fas löst in der rezeptortragenden Zelle apoptotischen Zelltod aus. Dies spielt eine besondere Rolle für verschiedenen Funktionen des Immunsystems, z.B. für die Lyse von Zielzellen durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) und zytotoxische T-Zellen, für die Selbsteliminierung von Effektorzellen nach der Expansionsphase einer Immunantwort (activation-induced cell death; AICD), für die Aufrechterhaltung eines immunprivilegierten Status bestimmter Gewebe und für die Induktion und Erhaltung der peripheren Toleranz. Im Gegensatz zu dem von vielen Zelltypen konstitutiv exprimiertem Fas-Rezeptor ist die Expression und Aktivität des FasL auf wenige Zelltypen beschränkt (Zellen des Immunsystems und immunprivilegierte Gewebe) und wird auf transkriptioneller und post-translationaler Ebene reguliert. Ebenso wichtig wie die pro-apoptotische Funktion ist die Vermittlung nichtapoptotischer Signale durch den Fas-Rezeptor. So wurde unter anderem gezeigt, dass Fas-Aktivierung ko-stimulatorisch wirken und das Überleben, die Aktivierung und die Proliferation von T-Zellen und Tumorzellen fördern kann. Zusätzlich zu der Vermittlung des klassischen „Vorwärtssignals“ in die rezeptortragende Zelle kann FasL selbst Signale empfangen und in die ligandexprimierende Zelle weiterleiten. Dieses Phänomen wird als „reverse“ oder „bidirektionale“ Signalübertragung bezeichnet und wurde ebenfalls für andere TNFL-Familienmitglieder beschrieben. Erste Hinweise für die Existenz einer reversen Signalübertragung in die FasL-tragende Zelle stammen aus zwei Studien, in denen gezeigt wurde, dass die Vernetzung des FasL durch Fas-Fc oder anti-FasL-Antikörper die T-Zell-Rezeptor (TZR)-vermittelte Proliferation muriner CD8+ T-Zelllinien ko-stimuliert bzw. die muriner CD4+ T-Zellen inhibiert. In beiden Fällen hingen die beobachteten Veränderungen des Proliferationsverhaltens von der Anwesenheit eines funktionellen Liganden ab. Es ist anzunehmen, dass das retrograde Signal durch die intrazelluläre Domäne (IZD) des FasL vermittelt wird: (i) Die IZD ist speziesübergreifend konserviert und beinhaltet mehrere Signalmotive, darunter eine innerhalb der TNFL-Familie einzigartige PRD. (ii) Eine Vielzahl von Proteinen bindet über eine SH3 oder WW Domäne an die PRD des FasL und reguliert so verschiedene Aspekte der FasL-Biologie, wie z.B. die subzelluläre Lokalisation, die Expression an der Zelloberfläche und das Zusammenspiel mit intrazellulären Signalwegen. (iii) Post-translationale Modifikationen der IZD wurden mit der Sortierung des Liganden in Vesikel und der FasL-abhängigen Aktivierung von Nuclear factor of activated T cells (NFAT) in Verbindung gebracht. (iv) Die proteolytische Prozessierung des FasL führt zur Freisetzung der IZD in das Zytosol und ermöglicht die Translokation der IZD in den Zellkern, wo sie die Transkription von Genen regulieren kann. (v) Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression der FasL IZD ausreicht, um nach gleichzeitiger TZR-Stimulation und IZD-Vernetzung eine reverse Signalübertragung in murinen CD8+ T-Zelllinien zu initiieren. Die möglichen Konsequenzen der FasL-vermittelten reversen Signalübertragung werden kontrovers diskutiert, und sowohl ko-stimulatorische wie auch inhibitorische Funktionen sind publiziert worden. Diese sich widersprechenden Beobachtungen basieren vermutlich darauf, dass die Experimente in artifiziellen Systemen durchgeführt wurden und weder der molekulare Mechanismus, noch die physiologische Bedeutung der reversen Signalübertragung auf der Ebene des endogenen Proteins in vivo untersucht wurden. Daher wurde in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Martin Zörnig ein Mausmodell für eine defekte reverse FasL Signalübertragung (FasL Delta Intra) etabliert. Diesen ‚knockout/knockin’-Mäusen fehlt die intrazelluläre FasL Domäne, während die Transmembran- und die extrazelluläre Domäne weiterhin vorhanden sind. Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurden die FasL Delta Intra Mäuse phänotypisch charakterisiert und als Modell genutzt, um die physiologische Funktion der reversen FasL Signalübertragung auf molekularer und zellulärer Ebene aufzuklären. Um sicherzustellen, dass die FasL Delta Intra Mäuse ein geeignetes Modellsystem zur Analyse der reversen FasL Signalübertragung darstellen, wurden die Expression und Funktionalität des trunkierten FasL untersucht. Die korrekte Ausführung FasL/Fas-vermittelter Apoptose ist ein wichtiger Punkt, da natürlich vorkommende Maus-Mutantenstämme, in denen die Fas-induzierte Apoptose durch Mutationen im FasL (FasLgld/gld) bzw. im Fas (Faslpr/lpr) Gen inaktiviert wird, eine schwere Autoimmunerkrankung entwickeln. Ein vergleichbarer Phänotyp in FasL Delta Intra Mäusen könnte die Auswirkungen der defekten reversen Signalübertragung maskieren. Die Expression des FasL konnte durch RT-PCR und durchflußzytometrische Färbungen auf der Oberfläche aktivierter Lymphozyten in homozygoten FasL Delta Intra Mäusen verifiziert werden. Experimente, in denen aktivierte Lymphozyten mit Fas-sensitiven Zielzellen ko-kultiviert wurden, zeigten, dass der trunkierte FasL weiterhin Apoptose in Fas-tragenden Zellen auslösen kann. Außerdem weisen die FasL Delta Intra Mäuse im gesunden Zustand keinerlei phänotypische Auffälligkeiten auf und entwickeln keine Symptome der mit FasL-Defizienz (FasL gld/gld, FasL-/-) verbundenen lymphoproliferativen Autoimmunerkrankung. Da die meisten Studien eine Beeinflussung der T-Zell Expansion durch die reverse FasL Signalübertragung nahe legen, wurde das Proliferationsverhalten von Lymphozyten aus homozygoten FasL Delta Intra oder Wildtyp Mäusen nach Stimulation des jeweiligen Antigenrezeptors analysiert. Experimente zur aktivierungsinduzierten Lymphozytenexpansion belegten eine deutlich höhere Proliferationskapazität von einzelpositiven CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie B-Zellen ohne IZD. Dieser Effekt war in B-Zellen am stärksten ausgeprägt und konnte in CD4+ T-Zellen nur dann beobachtet werden, wenn zuvor regulatorische CD4+CD25+ T-Zellen (Tregs) depletiert wurden. Nach unserem Kenntnisstand beschreibt die vorliegende Arbeit zum ersten Mal die Auswirkungen der reverse FasL Signalübertragung in B-Zellen. Um zu verstehen, wie reverses FasL-Signaling auf aktivierungsinduzierte Lymphozytenproliferation einwirkt, wurde das Anschalten verschiedener Signalwege, die bekanntermaßen für die vom Antigenrezeptor ausgehende Signalverarbeitung wichtig sind, untersucht. Als ein molekulares Korrelat für die beobachtete verstärkte Proliferation wurde eine deutlich erhöhte Phosphorylierung der Extracellular signal regulated kinase (ERK1/2) nach Vernetzung des Antigerezeptors in homozygoten FasL Delta Intra Mäusen gefunden. Überraschenderweise schienen die ERK1/2-vorgeschalteten Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) Raf-1 und MEK1/2 nicht für die differentielle Regulation von ERK1/2 verantwortlich zu sein, da die Stimulation von Wildtyp und FasL-mutanten B-Zellen zu einem vergleichbaren Ausmaß aktivierender Phosphorylierungen in c-Raf1 (S38) und MEK1/2 (S218/S222) führte. Ebenso wiesen Experimente, in denen die aktivierungsinduzierte Akt-Phosphorylierung (S473) untersucht wurde, nicht auf eine Beteiligung des Phosphoinositol-spezifische Kinase 3 (PI3K)/Akt Signalwegs an der reversen FasL Signalübertragung hin. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass durch Phospholipase C gamma (PLC gamma) und Proteinkinase C (PKC) vermittelte Signale in die FasL-abhängige Regulation von ERK1/2 involviert sind. Unsere Gruppe konnte zeigen, dass FasL in einer ähnlichen Weise wie das Signalprotein Notch prozessiert wird. Dies führt nach proteolytischer Freisetzung der FasL IZD in das Zytoplasma zur transkriptionellen Regulation eines Reportergens. Des Weiteren wurde in der Arbeitsgruppe von PD Dr. M. Zörnig eine Interaktion der FasL IZD mit dem Transkriptionsfaktor Lymphoid-enhancer binding factor-1 (Lef-1) aufgezeigt, die die Lef-1-abhängige Transkription beeinflusste. Daher wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine systematische Expressionsanalyse aktivierter Lymphozyten durchgeführt. Die dabei identifizierten Zielgene der reversen FasL Signalübertragung wurden durch quantitative real-time PCR (qRT-PCR) verifiziert. Es stellte sich heraus, dass vor allem Gene, die mit der Proliferation und Aktivierung von Lymphozyten assoziiert werden, in homozygoten FasL Delta Intra Mäusen stärker exprimiert werden. Interessanterweise wurde ebenfalls eine extensive Regulation von Genen, die mit Lef-1-abhängigen Wnt/beta-Catenin-Signalen im Zusammenhang stehen, beobachtet. Obwohl andere Publikationen nahe legen, dass die Expression von Lef-1 während der B-Zell-Entwicklung stark herunterreguliert wird, konnten in der vorliegenden Arbeit Lef-1 mRNA (RT-PCR) und Protein (intrazelluläre, durchflußzytometrische Färbung) in naïven B-Zellen detektiert werden. Diese Daten weisen auf einen Zusammenhang von reverser FasL Signalübertragung und Lef-1 in reifen Lymphozyten hin. Zur Aufklärung der in vivo Funktion reverser FasL Signalübertragung wurden verschiedene Infektions- und Immunisierungsmodelle angewendet, mit denen eine mögliche Beteiligung der FasL IZD an der Regulation von Immunantworten untersucht werden kann. Experimente, in denen die Thymozytenproliferation oder die Expansion Antigen-spezifischer T-Zellen in Folge einer Infektion mit dem Superantigen Staphylococcus enterotoxin B (SEB), mit dem Lymphozyten Choriomeningitis Virus (LCMV) oder dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes evaluiert wurden, ergaben vergleichbare Ergebnisse in Wildtyp und FasL Delta Intra Mäusen. Auch die Rekrutierung von Neutrophilen in einem Thioglycollat-induzierten Peritonitismodell wurde nicht von der Deletion der FasL IZD beeinflußt. Möglicherweise spiegeln diese Befunde in vivo aktive, regulatorische Mechanismen wider, wie z.B. eine durch regulatorische T-Zellen ausgeübte Kontrolle. Ein Hinweis darauf ist die ex vivo Beobachtung, dass Unterschiede in der Proliferation von Wildtyp und mutanten CD4+ T-Zellen nur beobachtet werden konnten, wenn regulatorische T-Zellen vorher depletiert wurden. Außerdem zeigen verschiedene in vitro Studien, dass retrograde FasL-Signale nur bei sub-optimaler Lymphozyten-Stimulation beobachtet werden können, nicht aber bei optimaler Vernetzung des TZR. Daher könnten Stimuli wie SEB oder LCMV durch die starke Initiation von Antigenrezeptorsignalen die inhibitorische Funktion der reverse FasL Signaltransduktion maskieren. Im Einklang mit der ex vivo beobachteten Hyperaktivierung von Lymphozyten ohne FasL IZD wurden in FasL Delta Intra Mäusen nach Immunisierung mit dem Antigen 3- hydroxy 4-nitrophenylacetyl (NP) signifikant mehr Keimzentrums-B-Zellen gebildet. Ein erhöhter prozentualer Anteil Plasmazellen in der Milz von FasL Delta Intra Mäuse korrelierte mit signifikant höheren Titern NP-bindender, d.h. Antigen-spezifischer IgM- und IgG1-Antikörper im Serum. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die reverse Signalübertragung via FasL immunmodulatorische Funktionen ausübt. Damit übereinstimmend konnte in einem Model der Ovalbumin-induzierten allergischen Atemwegsentzündung gezeigt werden, dass retrograde FasL Signale den Krankheitsverlauf durch Verminderung der Immuneffektorzellrekrutierung und Verstärkung der T-Zell Aktivierung abmildern. Die hier beschriebenen, auf endogenem Proteinniveau erhaltenen, ex vivo und in vivo Befunde zeigen, dass die reverse Signalübertragung durch die FasL IZD unter bestimmten Bedingungen immunmodulatorische Funktionen übernimmt. Dabei könnte die reverse FasL Signalübertragung ein Mechanismus zur Termination und Feinabstimmung von Immunantworten sein, der zur Prävention von Autoimmunerkrankungen beiträgt. Zukünftige Studien an geeigneten Mausmodellen für Autoimmunerkrankungen werden diese Möglichkeit untersuchen.