Open Access

Katrin Schulze

• Die gezielte Modifikation von Proteinen für die Erforschung des Proteoms stellt eine entscheidende Herausforderung dar. Sie wird meistens dann zwingend notwendig, wenn das intrinsische Signal zum Auslesen ungeeignet ist. So ist es z.B. für die größte Anzahl von fluoreszenzbasierenden Methoden unerlässlich, das zu untersuchende Protein spezifisch und einheitlich mit einem Fluorophor zu markieren. Eine weitere Schwierigkeit ist die gerichtete Immobilisierung von Proteinen für deren Charakterisierung an Oberflächen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die spezifische Markierung, Manipulation und strukturierte Immobilisierung von rekombinanten Proteinen analysiert. Dafür wurde mit dem hauptsächlich aus der Proteinreinigung bekannten NTA/Oligohistidin-System gearbeitet. Verwendet wurden multivalte NTA-Chelatorköpfen mit zwei (bisNTA), drei (trisNTA) oder vier (tetrakisNTA) NTA-Gruppen pro Molekül. Durch die Multivalenz können hervoragende Bindungsaffinitäten im nanomolaren Bereich erzielt werden, die die stabile, stöchiometrische, nicht kovalente und damit reversible Modifikation His-getaggter Proteine in Lösung und an Grenzflächen erlaubt. Fluoreszente trisNTAs wurden vielfach erfolgreich für die Markierung His-getaggter Proteine eingesetzt. Dabei wurde die Beobachtung gemacht, dass die Ni2+-Ionen im trisNTA die Emission des benachbarten Fluorophors stark quenchen und dadurch die Einsatzmöglichkeiten der Verbindung reduzieren. Durch die räumliche Trennung der beiden Gruppen mit starren, biokompatiblen Polyprolin-Helices konnte erstmals systematisch demonstriert werden, dass das Ausmaß der Fluoreszenzlöschung abstandsabhängig ist. Bei der Verwendung von 12 Prolinen (3.6 nm lange Helix) wurde mit einem ATTO565-Derivat eine Intensitätserhöhung um etwa 70%, und bei einem OregonGreen488-Derivat um etwa 40% erreicht. Bei den Verbindungen können der Abstand der beiden Gruppen voneinander und der Fluorophor nahezu frei gewählt werden, so dass eine Optimierung in Hinblick auf die jeweilige Fragestellung ohne Probleme möglich ist. In Kooperationen untersucht wurden z.B. die ATP-Hydrolyse von MDL1 und die ATP-Bindung von TAP. Die deutlich verbesserte Quantenausbeute, die stabile Bindung an einen His-Tag und die geringe Größe machen die Verbindungen zu idealen Reportersonden für die Einzelmolekül-Fluoreszenz-Analyse. Die gezielte Manipulation eines makromolekularen Proteinkomplexes mit einem kleinen Molekül wurde in einem weiteren Projekt untersucht. Das tetrakisNTA wurde verwendet, um die His-getaggten Eingänge des alphaN-His6 Proteasoms von Thermoplasma acidophilum gezielt zu blockieren. Durch den Abbau von Fluoreszein-markiertem Casein konnte die Aktivität der Proteasomkomplexe in Echtzeit verfolgt werden. Unter Zugabe von tetrakisNTA fand kein Abbau statt, während dieser ohne oder nach Entfernen der tetrakisNTAs von den Eingängen im gleichen Maße detektierbar war. Die Aktivität der Peptidase-Schnittstellen im blockierten Zustand konnte durch die Überschichtung eines nativen Gels mit einem Peptidsubstrat demonstriert werden. Die Ergebnisse belegen, dass die His-Tags an den Eingängen des Proteasomkomplexes so umstrukturiert werden, dass der Eintritt von Proteinen reversibel blockiert wird. Neben der gezielten Manipulation des Proteasoms wurde außerdem erstmals die spezifische Fluoreszenzmarkierung His-getaggter Proteine in kompletten E. coli Zelllysaten mittels nativer PAGE nachgewiesen. Um neue Anwendungsgebiete für das trisNTA zu erschließen, sollte dieses mit einem 1.4 nm großen Goldcluster modifiziert werden. Damit könnte die Position von His-Tags in Proteinkomplexen mittels Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Mittels Gelfiltration mit MBP-H6 wurde nachgewiesen, dass die entwickelten Goldcluster teilweise mehr als eine trisNTA-Gruppe auf der Oberfläche hatten, wobei eine Trennung der Partikel nach der Anzahl der NTA-Gruppen nicht möglich war. Die Partikel wurden erfolgreich für die spezifische Markierung des alphaN-His6 Proteasoms verwendet. In der Einzelpartikelanalyse deutlich erkennbar waren der markierte Proteasomkomplex und die Lage des trisNTA-Goldclusters. Die Verwendung solcher Goldpartikel in der EM bringt entscheidende Vorteile im Hinblick auf die Strukturaufklärung von Proteinen mit sich. Orthogonale NTA/His-Tag Bindungspaare, bei denen ein bestimmtes, multivalentes NTA-Molekül einen definierten His-Tag bindet, würden einen großen Nutzen für die spezifische Markierung oder Immobilisierung verschiedener His-getaggter Proteine bringen. Durch die Verwendung teilweise rigider His-Tags und möglichst starrer bisNTAs sollten solche Bindungspaare realisiert werden. Die Synthese rigider bisNTAs mit unterschiedlichen Abständen zwischen den NTA-Gruppen konnte erfolgreich etabliert werden. Allerdings zeigten Fluoreszenztitrationen mit verschieden Fluoreszeinmarkierten His-Peptiden nicht die erhofften Unterschiede in den Affinitäten. Im letzten Teil der Arbeit wurden durch intramolekulare His-Tags inaktive trisNTAs synthetisiert. Diese können durch Licht gespalten und damit aktiviert werden (photoaktivierbare trisNTAs, PAtrisNTAs). Die Verbindungen mit unterschiedlicher Anzahl an Histidinen im intramolekularen Tag wurden systematisch in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Dazu wurden HPLC-Studien, Gelfiltrationen und SPR-Experimente durchgeführt. Die strukturierte Organisation von Proteinen auf solchen lichtaktivierbaren Oberflächen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie demonstriert. Außerdem konnten durch die Laserlithographie gezielt verschiedene His-getaggte Proteine in situ in definierten Bereichen immobilisiert werden. Die Biokompatibilität der Oberflächen wurde erfolgreich durch die strukturierte Organisation aktiver, Virusbindender Rezeptor-Partikel gezeigt. Im Prinzip sollte das Konzept die lichtinduzierte Aufkonzentrierung von His-getaggten Rezeptoren in lebenden Zellen ermöglichen. Durch das Clustern ausgelöste Vorgänge könnten so gezielt herbeigeführt und analysiert werden.
• The specific modification of proteins plays a crucial role in the field of proteomics and is mostly mandatory if a read-out signal needs to be detected. E.g., for the majority of fluorescent assays a specific and unique labeling of the protein of interest with a fluorophor is required. Another important challenge is the directed immobilization of proteins at interfaces to contribute to their characterization. The specific labeling, manipulation and structured immobilization of recombinant proteins were in the scope of this thesis. For this purpose, the well known NTA/oligohistidine system, widely used for protein purification, was applied. Multivalent NTA chelator heads with two (bisNTA), three (trisNTA) or four (tetrakisNTA) NTA groups per molecule were applied to the different projects. The multivalency causes excellent binding properties with nanomolar affinities, thus enabling a stable, stoichiometric, non covalent, and reversible modification of His-tagged proteins in solution and on solid supports. Fluorescent trisNTAs have been widely used for the successful labeling of His-tagged proteins. Thereby the observation was made, that the Ni2+ ions in the trisNTA quench the emission of the neighboring fluorophor, limiting the possible applications of the compounds. The spatial separation of the two groups by rigid, biocompatible polyproline helices was investigated systematically. It has been shown for the first time, that the quenching efficiency definitely depends on the distance between the trisNTA and the fluorophor. Insertion of 12 prolines leads to an increase in the fluorescence intensity of about 70% for an ATTO565-derivative and of about 40% for an OregonGreen488-derivative. The compounds can easily be adopted to any problem, as the distance between the two groups and the fluorophor can be chosen as required. Using appropriate constructs, the ATP-hydrolysis of MDL1 as well as the ATP-binding of TAP were studied in cooperations. Due to the obviously increased quantum yield, the stable binding to His-tagged proteins and the small size, the compounds are ideal probes for single molecule fluorescence studies. The specific manipulation of a macromolecular protein complex by a small molecule was investigated in another project. The tetrakisNTA was chosen to specifically block the His-tagged entrances of the alphaN-His6 proteasome from Thermoplasma acidophilum. The activity of the proteasome was monitored in real time by the degradation of fluorescein-labeled casein. No degradation could be observed in the presence of tetrakisNTA. A clear and comparable activity was detectable without tetrakisNTA or after removal of the tetrakisNTA from the entrances. The remained peptidase activity of the blocked proteasomes was shown by covering a native gel with a peptide substrate. The results clearly demonstrated, that the His-tags at the entrances of the proteasome are reorganized by the tetrakisNTA and that this reorganization leads to a reversible blockage of the proteasome. Besides it has been shown successfully by native PAGE that the specific labeling of His-tagged proteins in complete E. coli cell lysates is feasible. To open up a new field for application of the multivalent NTAs, the modification of the trisNTA with a 1.4 nm large gold cluster was another challenge. This would allow the visualization of the His-tag position within a protein complex by electron microscopy. As shown by gelfiltration experiments with hexahistidine-tagged MBP, most of the gold clusters were functionalized with more than a single trisNTA group on their surfaces. Separation of the particles by the number of the trisNTA groups was not possible. The gold clusters were used successfully for the specific labeling of the alphaNHis6 proteasome. The labeled proteasome complexes as well as the positions of the gold clusters were clearly visible in single particle analysis using electron microscopy images. The application of such gold clusters in EM offers great advantages in the field of structure determination of proteins. For the specific labeling or immobilization of different His-tagged proteins it would be beneficial to have access to orthogonal NTA/His-tag binding pairs, which means that a determined, multivalent NTA chelator head can only bind to a single defined His-tag. The project was to be realized by using partially rigid His-tags and preferably inflexible bisNTAs. Rigid His-peptides were realized by implementing stiff polyproline-helices between cumulated histidines. The synthesis of inflexible bisNTA compounds, possessing different distances between the two NTA groups, was accomplished successfully. However, fluorescence titrations with different fluorescein labeled His-peptides revealed no differences in binding affinities. It is likely, that the fluorescein interacts with the histidines. This interaction would disturb the measurement of the NTA/histidin interaction. In the last project of this thesis it was planed to generate self-inactivated trisNTAs for the triggered modification of proteins. Therefore, trisNTAs with intramolecular His tags were synthesized, which formed an intramolecular complex upon loading with Ni2+ ions. Variation of the number of inactivating histidines allows to control the efficiency of the self-inactivation. Activation is achieved by a photocleavage reaction, eliminating the inactivating, intramolecular His-tag and providing a free trisNTA. The versatility of these novel photoactivatable trisNTAs for in vitro protein labeling and immobilization was demonstrated in solution and on surfaces. Therefore, HPLC studies, gelfiltrations, and SPR experiments were performed. The structured organization of fluorescent proteins was demonstrated by CLSM. Multiplexing of different fluorescently labeled proteins in defined areas could be reached easily by laser lithography. Also proven was the acceptability of the biofunctional surfaces in a challenging physiological application where large, complex and macromolecular virus/receptor interactions were specifically probed. In principle, the concept should allow for the light triggered receptor clustering in living cells and investigation of the associated signal transduction processes.