Open Access

Markus Persike

• Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine allgemein anwendbare Methode zur Identifizierung und Quantifizierung kleiner Moleküle mittels MALDI-TOF-MS entwickelt. Dabei wurden zahlreiche Analyten, wie unterschiedliche Arzneistoffe, Neurotransmitter und Lebensmittelinhaltsstoffe in verschiedenen Probenmatrizes analysiert. Bei den verwendeten Matrizes wurden mit a-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (CHCA) die besten Ergebnisse erzielt. Es zeigte sich jedoch, dass die Probenpräparation wichtiger war als die Wahl der Matrix, da auch mit anderen Matrizes bei optimierter Probenpräparation sensitive Messungen im niedrigen Massenbereich möglich waren. Insbesondere eine schnelle Trocknung des Probenspots, und damit verbunden die Bildung kleiner Kristalle, ist für die Analytik kleiner Moleküle hilfreich. Bei gleichzeitiger Verwendung geringer Matrixkonzentrationen und geringer Laserintensität konnte so der störende Matrixhintergrund minimiert werden. Eine noch stärkere Suppression der Matrixsignale bei gleichzeitiger Anreicherung der Analyten auf dem Probenspot konnte durch eine Dünnschichtpräparation (TLP) mit CHCA und Nitrozellulose erreicht werden. Allerdings war die TLP für eine automatische Quantifizierung kleiner Moleküle nur bedingt geeignet. Die für kleine Moleküle so wichtige Quantifizierung war durch Verwendung einer optimierten schnell trocknenden Dried Droplet Präparation (DDP) möglich. Die Kombination dieser optimierten DDP mit ausreichend aufsummierten Einzelschussspektren bei gleichzeitiger Verwendung eines internen Standards (IS) ermöglichte eine valide Quantifizierung mit guter Präzision, Linearität und Richtigkeit. Dabei erfüllten die quantifizierten Analyten die Vorgaben der FDA für Präzision und Richtigkeit. Diese Quantifizierungsmethode wurde an Mischungen unterschiedlicher Arzneistoffe, sowohl in Standardlösungen als auch in humanem Plasma, erfolgreich durchgeführt. Dabei genügte ein einziger interner Standard, um alle Arzneistoffe der Mischung schnell und sensitiv zu bestimmen (Bestimmungsgrenze 1-5 ng/ml). Weiterhin war es möglich, den Wirkstoff einer pharmazeutischen Tablette ohne aufwändige Probenvorbereitung schnell und genau zu bestimmen. Dass MALDI über eine hohe Salztoleranz verfügt, wurde bei der Bestimmung von Acetylcholin (ACh) und Cholin (Ch) in Mikrodialysaten bestätigt. Trotz des hohen Salzgehalts der Proben (~150 mM) war eine direkte Messung ohne vorherige Aufarbeitung möglich. Dabei lag die Nachweis- und Bestimmungsgrenze für ACh bei 0,3 bzw. 1 fmol/µl und für Ch bei 20 bzw. 100 fmol/µl. Nach den Standardlösungen wurden in-vivo Mikrodialysate aus dem rechten Striatum verschiedener CD1-Mäuse quantifiziert. Durch Verbindung der Dialysesonde mit einem MALDI-Spotter konnte außerdem die zeitliche Auflösung der Dialyse deutlich verbessert werden. Ein weiterer Anwendungsbereich stellte die Bestimmung von Melamin in Milch und Milchpulver dar. Nach einfacher Probenvorbereitung war es möglich, Melamin mit einer Bestimmungsgrenze von 0,25 ppm in Milchpulver bzw. 0,625 ppm in Milch direkt und schnell zu quantifizieren. Damit wurden die geforderten Grenzwerte von 1 ppm für Babynahrung bzw. 2,5 ppm für übrige Lebensmittel leicht erreicht. Als letzte Methode wurden verschiedene Inhaltstoffe in Energy Drinks bestimmt. Bei Verwendung von Theophyllin als IS konnte so neben Koffein auch Niacin und Pyridoxin erfolgreich und ohne Probenvorbereitung schnell quantifiziert werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass MALDI auch für die Analytik kleiner Moleküle gut geeignet ist. Neben der Identifizierung der Analyten war auch die Quantifizierung mit guter Linearität, Reproduzierbarkeit und Richtigkeit möglich. Dabei konnten mit der Standardmatrix CHCA verschiedenste niedermolekulare Analyten in unterschiedlichsten Probenmatrizes bestimmt werden. Im direkten Vergleich war die Sensitivität der vorgestellten MALDI-Methoden mindestens vergleichbar, wenn nicht gar besser als bestehende LC-MS-Methoden. Da auf den Einsatz einer LC verzichtet werden kann, ermöglich MALDI einen sehr viel höheren Probendurchsatz. Zudem war keine spezielle Matrix, besondere Geräte oder zeitaufwändige Probenvorbereitung und Präparation notwendig.
• A generally applicable method for the identification and quantification of small molecules by MALDI-TOF-MS was developed. A large number of analytes, such as different drugs, neurotransmitters and food ingredients in different sample matrices were analyzed. The best results have been achieved with the MALDI matrix a-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid (CHCA). It appears, however, that the sample preparation is more important than the choice of matrix. Also, with the use of other matrices, a sensitive analysis in the low mass range was possible. A rapid drying of the sample spots and the associated formation of small crystals is useful for the analysis of small molecules. The use of low matrix concentrations and low laser intensity could minimize the disturbing matrix background. An even greater suppression of matrix signals and an enrichment of the analytes on the sample spot was achieved by a thin layer preparation (TLP) with CHCA and nitrocellulose. Quantification of small molecules was carried out with an optimized dried droplet preparation method (DDP). The combination of the optimized DDP and the use of an internal standard (IS) allowed for quantification with good precision, linearity and accuracy. The quantified analytes met the requirements of the FDA for precision and accuracy. The quantification method was carried out successfully for mixtures of different drugs in standard solutions as well as in human plasma. A single internal standard was sufficient to determine all drugs in the mixture (limit of quantification: 1-5 ng/ml). Furthermore, it was possible to determine the active ingredient of a pharmaceutical tablet quickly and accurately. The high salt tolerance of MALDI was demonstrated by the determination of acetylcholine (ACh) and choline (Ch) in microdialysates. Despite the high salt content of the samples (~ 150 mM), a direct measurement was possible. The detection and quantification limit was 0.3 and 1 fmol/µl in the case of ACh, and respectively 20 and 100 fmol/µl for Ch. In vivo microdialysates from the right striatum of different CD1 mice were quantified. By connecting the dialysis probe with a MALDI spotter, the time resolution of the dialysis was improve significantly. In another experiment, melamine in milk and milk powder was determined. After a simple sample preparation, melamine was analysed directly with a limit of quantification of 0.25 ppm in milk powder and 0.625 ppm in milk. Thus, the required limits of 1 ppm for infant formula and 2.5 ppm for other foods were reached easily. Finally, different ingredients in energy drinks, such as caffeine, niacin and pyridoxine were successfully quantified without sample preparation using theophylline as IS. In summary, this work shows that MALDI is also suitable for the analysis of small molecules. In addition to the identification also a quantification with good linearity, reproducibility and accuracy was possible. This could be determined in different sample matrices with various low molecular analytes. A direct comparison of the sensitivity of the presented MALDI-methods was comparable or even better than existing LC-MS methods. MALDI allows for a much higher sample throughput, because the use of LC is not necessary. Moreover, no special matrix, special equipment or time-consuming sample preparation was necessary.