Open Access

Marco Marcia

• This work presents the first complete structure of the membrane protein sulfide:quinone oxidoreductase (SQR), obtained by X-ray crystallography. Its description is complemented by the results of biochemical and functional experiments. SQRs are ubiquitous flavoprotein disulfide reductases (FDRs), present in all domains of life, including in humans. Their physiological role extends from sulfide detoxification to sulfide-dependent respiration and photosynthesis (in archaea and bacteria), to heavy metal tolerance (in yeast) and possibly to sulfide signalling (in higher eukaryotes). Until now understanding the function of SQRs was difficult because of the poor level of sequence conservation in this enzyme family, the limited functional characterization available and the absence of any structural data. SQR was identified in the native membranes of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus by peptide mass fingerprinting (PMF) and by a spectrophotometric activity assay. The protein was solubilized in the detergent dodecyl-beta-D-maltoside (DDM) and purified to homogeneity in a functionally active state. It binds one FAD molecule per protein monomer and FAD is its only cofactor. Its structure was determined in the “as-purified”, substrate-bound and inhibitor-bound forms at resolutions of 2.3, 2.0 and 2.9 Å, respectively. It is composed of two Rossmann-fold domains and of one membrane-attachment region. Despite the overall monomeric architecture being similar to that of FDRs, the structure reveals properties that had not been observed in FDRs until now and that have strong implications for the SQR catalytic mechanism. Surprisingly, A. aeolicus SQR is trimeric in the crystal structure and in solution, as determined by density-matched analytical ultracentrifugation, cross-linking and single particle electron microscopy. The trimer creates an appropriate surface for binding lipids and thus ensures that SQR exclusively reduces hydrophobic quinones. SQR inserts to a depth of about 12 Å into the membrane as an integral monotopic membrane protein. The interaction is mediated by an amphipathic helix-turn-helix tripodal motif and two lipid clamps. A channel in the membrane-binding domain extends towards the si-side of FAD and represents the quinone-binding site. The quinone ring is sandwiched between the conserved amino acids Phe 385 and Ile 346 and is possibly protonated upon reduction via Glu 318, Lys 382 and/or neighboring solvent molecules. Sulfide polymerization occurs on the re-side of FAD, where the highly conserved Cys 156 and Cys 347 appear to be covalently bound to the putative product of the reaction, a polysulfur chain which takes the form of an S8 ring in some monomers. Finally, the structure shows that FAD is covalently connected to the protein in an unprecedented way, via a putative disulfide bridge between the 8-methyl group of the isoalloxazine moiety and Cys 124. The high resolution insight into the protein and all unexpected structural observations presented in this work suggest that the catalytic mechanism of SQRs is significantly different from that of FDRs. In agreement with the structural and functional data, two reaction schemes are proposed for A. aeolicus SQR. They both provide a detailed description of how sulfide and quinones reach and bind the active site, how electrons are transferred from sulfide to quinone via FAD and how the elongating polysulfur product is attached to the polypeptide and is finally released. The two hypotheses differ in defining the structure of the covalent protein-FAD intermediate that forms during the reaction cycle and whose identity still remains experimentally undetermined. Remarkably, the structure of the active site and the FAD-binding mode of A. aeolicus SQR are not conserved in another SQR structure which also became available recently, that of the archaeon Acidianus ambivalens. The variability in SQRs suggests that not all of these enzymes follow the same catalytic mechanism, despite having been considered homologous. Consequently, the currently available but contradictory sequence-based classifications of the SQR family were revised. A structure-based alignment calculated on the increasing number of available sequences allowed to define new SQR groups and their characteristic sequence fingerprints in agreement with the reported structural and functional data. In conclusion, the results obtained in this work offer for the first time a detailed look into the intriguing but complicated reactions catalysed by SQRs and provide a stimulus for further genetic, biochemical and structural investigation.
• Diese Arbeit stellt die erste vollständige Röntgenkristallstruktur des Membranproteins Sulfid:Chinon Oxidoreduktase (SQR) vor. Die Beschreibung der Struktur, wird durch die biochemische und funktionelle Charakterisierung des Enzyms ergänzt. SQRs sind ubiquitäre Flavoprotein-Disulfid-Reduktasen (FDRs), die in allen Domänen des Lebens, darunter auch im Menschen, vertreten sind. Ihre physiologische Funktion reicht von der Sulfidentgiftung bis hin zur sulfidabhängigen Atmung und Photosynthese (in Archaea und Bakterien), zur Schwermetalltoleranz (in Hefen) und vermutlich zur sulfidabhängigen Signalübertragung (in höheren Eukaryoten). Bis heute war es schwierig, die Funktion der SQRs zu verstehen, da diese Familie eine geringe Sequenzidentität aufweist, nur wenig funktionell charakterisiert war und keine strukturellen Daten zur Verfügung standen. Die SQR wurde in den Plasmamembranen des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus durch einen Peptidmassen Fingerabdruck (PMF) und einen spektrophotometrischen Aktivitätstest identifiziert. Das Protein wurde mit dem Detergenz Dodecyl-β-D-maltosid (DDM) solubilisiert und in aktiver Form bis zur Homogenität gereinigt. Jedes Monomer bindet ein FAD Molekül, welches der einzige Cofaktor ist. Die Struktur der SQR wurde in der „wie-gereinigten“, der Substrat-gebundenen und der Inhibitor-gebundenen Form mit einer Auflösung von 2,3, 2,0 bzw. 2,9 Å bestimmt. Sie besteht aus zwei Rossmann-Domänen und einer Membrankontaktregion. Obwohl die Architektur des Monomers derjenigen von FDRs ähnelt, zeigt die Struktur Merkmale, die bisher noch nicht beobachtet wurden, jedoch groβe Auswirkungen auf den katalytischen Mechanismus der SQRs haben. Die SQR von A. aeolicus liegt überraschenderweise im Kristall als Trimer vor, was durch analytische Ultrazentrifugation (AUC), Crosslinking und Einzelpartikelanalyse auch als native Form in Lösung bestätigt wurde. Das Trimer erzeugt eine passende Oberfläche für die Bindung an die Membran und stellt dadurch sicher, dass die SQR ausschließlich membranassoziierte Chinone reduziert. Die SQR sitzt als integrales monotopisches Membranprotein bis zu einer Tiefe von etwa 12 Å in der Membran. Die Interaktion wird durch zwei amphipatische Helices und zwei spezifische Lipid-Bindestellen vermittelt. Ein Kanal, der von der Membranbindedomäne zur si-Seite des FAD reicht, repräsentiert die Chinon-Bindestelle. Der Chinon-Ring ist zwischen den zwei konservierten Aminosäuren Phe 385 und Ile 346 gebunden und wird nach der Reduktion vermutlich von Glu 318, Lys 382 und/oder den in der Nähe lokalisierten Wassermolekülen protoniert. Die Sulfid-Polymerisierung hingegen geschieht auf der re-Seite des FAD. Hier sind die hoch konservierten Aminosäuren Cys 156 und Cys 347 kovalent an eine Polyschwefelkette gebunden, die in manchen Monomeren die Form eines S8 Rings annimmt und vermutlich das Produkt der Reaktion ist. Schließlich zeigt die Struktur eine ungewöhnliche kovalente Bindung der 8-Methylgruppe von FAD zu Cys 124, welche vermutlich eine Disulfidbrücke darstellt. Der detaillierte Einblick in das Protein und alle unerwarteten strukturellen Beobachtungen, die hier in dieser Arbeit gezeigt werden, deuten auf einen katalytischen Mechanismus der SQRs hin, der sich signifikant zu dem der anderen FDRs unterscheidet. In Übereinstimmung mit den strukturellen und funktionellen Daten werden zwei Reaktionsmechanismen für SQRs vorgeschlagen. Beide erklären wie Sulfid und Chinon in das aktive Zentrum gelangen und binden, wie Elektronen vom Sulfid über FAD zum Chinon übertragen werden und wie das Polyschwefelprodukt, das an die Polypeptidkette gebunden ist, verlängert und schließlich abgegeben wird. Der Unterschied beider Hypothesen liegt in dem kovalenten Protein-FAD Intermediat, das sich während des Reaktionszyklus bildet und dessen Struktur experimentell noch nicht bestimmt wurde. Interessanterweise zeigt die Struktur der SQR von Acidianus ambivalens, welche seit kurzem auch zur Verfügung steht, Unterschiede im aktiven Zentrum und in der FAD-Bindestelle zur SQR von A. aeolicus. Diese Variabilität der SQRs deutet darauf hin, dass nicht alle diese Enzyme dem gleichen katalytischen Mechanismus folgen, obwohl sie bisher als homolog betrachtet wurden. Folglich, wurden die verfügbaren aber widersprüchlichen sequenzbasierten Klassifizierungen der SQR Familie wieder aufgegriffen. Da die entscheidenden Sequenzabschnitte nun bekannt waren, erfolgte die Einteilung der Gruppen durch einen strukturbasierten Abgleich der steigenden Anzahl an verfügbaren Sequenzen und wurde mit den vorhandenen strukturellen und funktionellen Daten in Einklang gebracht. Diese Arbeit liefert erstmals einen tieferen Einblick in den faszinierenden aber komplexen Reaktionen, die SQRs katalysieren, und bietet eine Grundlage für weitere genetische, biochemische und strukturelle Untersuchungen.