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Muhammet Ali Çelikkiran

• Thalassämia major und Sichelzellanämie sind hereditäre Erkrankungen, die zu der Gruppe der quantitativen bzw. qualitativen Hämoglobinsynthesestörungen gehören und in unterschiedlichem Maße mit einer chronischen Anämie einhergehen. Dabei besteht die Therapie der Anämie in regelmäßigen Bluttransfusionen. Im Falle der Thalassämia major sind regelmäßige Bluttransfusionen alle 2-4 Wochen notwendig. Dabei übersteigt die damit zugeführte Eisenmenge bei weitem die Eisenausscheidungskapazität des Körpers, die limitiert und passiver Natur ist. Es kann dadurch zur Eisenüberladung des Körpers mit Erschöpfung der Eisenbindungskapazität und Nachweisbarkeit von freiem Eisen kommen. Freies Eisen generiert über die Fenton-Reaktion freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies, die ihrerseits in der Lage sind, biologische Moleküle sowie Zellstrukturen zu schädigen. Der Organismus verfügt über Mechanismen um diese Schäden zu verhindern bzw. den Ausmaß der Schäden zu begrenzen, die als antioxidativen Abwehrmechanismen bezeichnet werden. In dieser vorliegenden Arbeit wurden Blutproben von 22 Patienten mit ß-Thalassämia major und 16 Patienten mit Sichelzellanämie Patienten untersucht. Bei ihnen wurde das Vorliegen der pathologischen Modellsituation einer Eisenüberladung angenommen. Als Kontrollgruppe wurden 16 phänotypisch gesunde Geschwister der beiden Patientenkollektive herangezogen. Hauptziele dieser Arbeit war, die Bleomycin-Methode im Stoffwechsellabor des Zentrums für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität zu etablieren und dabei die folgenden Fragen zu klären: 1. Entsteht freies Eisen bei polytransfundierten Patienten? 2. Ist die Bleomycin-Assay zur Bestimmung des freien Eisens geeignet? 3. Welche Zusammenhänge bestehen zwischen den Parametern des Eisenstoffwechsels und können diese zur Abschätzung des freien Eisens genutzt werden? Freies Eisen entsteht dann, wenn die Eisenbindungskapazität des Transferrins überschritten wird. Bei gesunden Menschen liegt eine Transferrinsättigung im Durchschnitt bei unter 30%. Es ist also eine wertvolle Reserve vorhanden, um effektiv die Enstehung des freien Eisens zu verhindern. Bei bestimmten pathologischen Situationen, wie sie auch bei polytransfundierten Patienten bei Thalassämie vorliegen, wird dem Körper massiv Eisen zugeführt. Wir konnten bei 18 von 22 Patienten in der Thalassämiegruppe freies Eisen nachweisen. Der Median der freien Eisenkonzentration lag bei 1,25 μmol/l bei einer Spannbreite von 5,3μmol/l. In der Sichelzellanämiegruppe konnte nur bei einem Patienten freies Eisen nachgewiesen werden. Dieser hatte ebenfalls häufig Bluttransfusionen erhalten. Zur Messung des freien Eisens wurde die Bleomycin Methode nach Gutteridge et al angewandt. Es ist eine nasschemische Methode (Messung erfolgt via Spektroskopie) und erfordert keinen hohen technischen Aufwand. Da bei der Bestimmung des freien Eisens im mikromolaren Bereich geschieht, ist das Hauptproblem die Kontamination der Reagenzien durch das ubiquitär vorkommende Eisen. Durch höchste Sorgfalt und genaues Arbeiten im staubfreien Milieu und Behandlung der Reagenzien mit einem geeigneten Eisenkomplexbildner, wie z.B. Chelex100®, ist dieses Problem beherrschbar. Dennoch erfordert die Methode einen enormen Zeitaufwand, weshalb nach Parametern gesucht wurde, die zur Abschätzung oder zur Vorselektion der geeigneten Blutproben zur Bestimmung des freien Eisens herangezogen werden können. Wie oben schon erwähnt, hatten 18 von 22 Thalassämiepatienten freies Eisen im Blut. Davon hatten 15 eine Transferrinsättigung über 100% und 2 knapp unter 100%. Lediglich ein Patient, bei dem aber auch nur freies Eisen von 0,05 μmol/l gemessen wurde, hatte eine Transferrinsättigung deutlich unter 100%. Ein Patient aus der Sichelzellanämiegruppe, bei dem auch freies Eisen gemessen wurde, hatte ebenfalls eine Transferrinsättigung über 100%. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass eine hoch signifikante positive Korrelation zwischen dem freien Eisen und der Transferrinsättigung festegestellt wurde (r = 0,63, p = 0,002). 95% der Patienten, die freies Eisen im Blut hatten, wiesen auch Transferrinsättigungswerte über bzw. knapp unter 100% auf. Es besteht auch ein statistisch signifikanter positiver Zusammenhang zwischen der Serumeisenkonzentration und freiem Eisen. Alle Patienten mit freiem Eisen im Blut hatten Serumeisenwerte über 170 μg/dl. Damit konnte die Arbeitshypothese bestätigt werden, dass es bei polytransfundierten Thalassämiepatienten zu einer Eisenüberladung mit in der Folge entstehendem freiem Eisen kommt; bekannterweise induziert zweiwertiges Eisen die Fenton-Reaktion bzw. Haber-Weiss-Reaktion und damit oxidativen Stress. Bei Sichelzellanämiepatienten , die keine regelmäßigen Hochregimebluttransfusionen erhalten, die ebenso, wie in der Literatur beschrieben, oxidativem Stress ausgesetzt sind, müssen auch andere Pathomechanismen angenommen werden.
• Thalassaemia and sickle cell anaemia are hereditary diseases resulting from quantitative and qualitative disturbances of haemoglobin synthesis. Both diseases are accompanied by varying degrees of chronic anaemia, the treatment of which consists of blood transfusions on a regular basis. Blood transfusions in patients with thalassaemia major are necessary every 2- 4 weeks. Thus the amount of iron given exceeds by far the limited capacity of passive iron elimination from the body. This may lead to an iron overload resulting in an exhausted ironbinding capacity and production of ‘free’ iron.on. ‘Free’ iron produces, via the Fenton reaction, free radicals and reactive oxygen species, which can again damage cell structures and organic molecules. The organism has systems to prevent and limit such damage which are known as antioxidative defence mechanisms. Blood samples from 22 patients with beta-thalassaemia major and 16 patients with sickle cell anaemia were investigated for the purpose of this dissertation. The occurrence of a pathological iron overload in these blood samples was expected. 16 phenotypically healthy siblings were selected for the control group. Establishing the bleomycin method in the ‘Stoffwechsellabor des Zentrums für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität’ was the main aim of this dissertation and to answer the following questions: 1. Does free iron occur in patients because of polytransfusions? 2. Is the bleomycin method suitable for detecting “free” iron? 3. What is the relation between the different parameters of iron metabolism and are these parameters suitable for the estimation of “free” iron? Free iron occurs when the iron-binding capacity of transferrin is exceeded. Healthy human beings have an average transferrin saturation of <30%. This is a valuable reserve to prevent the occurrence of ‘free’ iron. Under certain conditions as in patients receiving polytransfusions, the body is subjected to a massive iron overload. We were able to verify ‘free’ iron in the blood of 18 of 22 patients within the thalassaemia group. The median “free” iron concentration was 1,25 &#956;mol/l with a maximum of 5,3&#956;mol/l. In the sickle cell anaemia group, free iron was only detected in one patient who had also been polytransfused. The bleomycin method of Gutteridge et al. was used to measure “free” iron. This is a photometric test which is simple to apply but because”free” iron is measured in the micromolar range, the main problem is the contamination of the reagents by native ubiquitous iron. This problem can be alleviated by working in a dust-free area and by exhaustive treatment of the reagents with an iron chelating agent (e.g. Chelex 100). Nevertheless, this method is extremely time-consuming and therefore parameters were sought to pre-select appropriate blood samples for assaying the “free” iron content. As mentioned above, 18 of 22 patients with thalassaemia had “free” iron in their blood and of these 18, 15 had a transferrin saturation of >100% and 2 patients of almost 100%. Only one patient with a “free” iron level of 0,05 &#956;mol/l had a transferrin saturation of considerably less than 100%. One patient within the sickle cell anaemia group in which “free” iron was measured also had a transferrin saturation of 100%. In summary, a highly significant positive correlation between “free” iron and the transferrin saturation could be determined (r = 0,63, P = 0,002). 95% of those patients having “free” iron in their blood also had a transferrin saturation of almost 100%. There was a statistically significant positive correlation between serum iron concentration and “free” iron level. All patients with “free” iron in their blood had a serum iron concentration of >170 &#956;g/dl. The hypothesis that polytransfusions in patients with thalassaemia major could lead to an iron overload and therefore to production of “free” iron was proven. It is well known that bivalent iron induces the Fenton or the Haber-Weiss-Reaction which in turn promotes oxidative stress. In those sickel cell anaemia patients who are not polytransfused but exhibit signs of oxidative stress as mentioned in the literature, the cause must be attributed to other pathomechanisms