Open Access

Fabian Nicolas Wolpert

• Ein erblich bedingter Funktionsverlust der DNA Mismatch Reparatur (MMR) Proteine hMSH2 und hMLH1 führt zu genetischer Instabilität und frühzeitiger Ausbildung von Krebserkrankungen, insbesonders des Kolons und des Endometriums. Diese Erkrankung wird nach ihrem Erstbeschreiber als Lynch Syndrom oder im Falle eines kolorektalen Karzinoms auch als erbliches nichtpolypöses kolorektales Karzinom (hereditary non polyposis colorectal cancer, HNPCC) bezeichnet. Neben der DNA Reparatur sind MMR Proteine auch an weiteren regulatorischen Prozessen wie genetischer Rekombination, Antikörperbildung sowie Zellzyklus Regulation und Apoptose beteiligt. Aus onkologischer Sicht ist besonders der letzte Punkt von Interesse, da man davon ausgeht, dass MMR Proteine bei exzessiven DNA-Schäden den Zellzyklus anhalten und entweder die DNA reparieren oder die Apoptose einleiten. Dies ist von klinischer Bedeutung, da viele Chemotherapeutika künstliche DNA-Läsionen hervorrufen, die in MMR defizienten Zellen weder zu einem Zellzyklus Stop noch zur Apoptose führen, so dass die Wirksamkeit bestimmter Substanzen vermindert ist. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorgelegten Dissertation ein Screening zur Identifikation von Interaktionspartnern von hMLH1 durchgeführt. hMLH1 ist hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, über Interaktionspartner im Zytoplasma ist bisher wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues bakterielles Zweihybrid-System etabliert. In diesem System besitzen die Wirtszellen keinen Zellkern, so dass die detektierten Interaktionen unabhängig von der intrazellulären Lokalisation stattfinden. Die Klone einer cDNA-Datenbank wurden mit hMLH1 in Bakterienzellen koexprimiert und die Interaktionen durch positives Zellwachstum auf Minimalnährböden angezeigt. Die positiven Klone wurden anschließend sequenziert und die Sequenz mit Hilfe der BLAST-Funktion mit der PubMed Online-Datenbank abgeglichen. Insgesamt wurden 108 bisher unbekannte Interaktionspartner von hMLH1 detektiert. Von diesen konnten zahlreiche Proteine den bekannten Funktionen der MMR zugeordnet werden. Von besonderem Interesse sind einige Interaktionspartner aus den Bereichen Zellzyklus Regulation (ANXA6, LPP2, NDRG1, PTP4A2/RH, RAPGEFL1, SPTLC2 und ARAF1), Apoptose (CTSB, CAPN5, DDX47, DES und Atmungskettenproteine) und ribosomale Proteine (EIF2A, EEF2, RPS2, RPS5 und RPS16). Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche dieser Interaktionspartner sich möglicherweise als prognostische bzw. prädiktive Biomarker nutzen lassen. Weiterhin könnten sich durch fundierte Kenntnis der Interaktion von MMR und Zellzyklus Regulation bzw. Apoptose neue Ansatzpunkte bei der Entwicklung zukünftiger therapeutischer Substanzen ergeben.
• Hereditary functional impairment of the DNA Mismatch Repair (MMR) proteins hMSH2 and hMLH1 lead to genetic instability and early onset of various malignancies, especially of colon and endometrium. This hereditary cancer syndrome has been firstly described by H.T. Lynch and is thereby called “Lynch Syndrome” or in case of colon carcinoma “Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC)”. Additionally to DNA repair, MMR proteins have been shown to be involved in other critical cellular processes such as genetic recombination, antibody generation, cell-cycle regulation and apoptosis. Especially those last two functions are of vital interest in the field of oncology, as MMR proteins are supposed to be key players in the recognition of DNA lesions and the initiation of cell-cycle arrest and/or apoptosis in case of excessive DNA damage. As many chemotherapeutic agents are causing artificial DNA lesions, which cannot initiate cell-cycle arrest in MMR deficient cells, this is of vital clinical importance. As hMLH1 is mostly located in the cellular nucleus, lots of information has been gathered about nuclear functions and interaction partners, though there is little known about functions of hMLH1 in the cytoplasm. Therefore, this screening for undiscovered interaction partners of hMLH1 has been performed by a new established bacterial two-hybrid-system. Here, host cells are prokaryotes and potential interaction partners can thereby interact quite independent of their original cellular compartment. The clones of a normal-colon tissue databank were coexpressed with hMLH1 in bacterial host cells and their interaction has been visualized by growth on minimal plates with different selection markers. Positive clones were sequenced and the encoded proteins identified by the PubMed BLAST online tool. 108 clones have been identified as new interaction partners of hMLH1 and most of them could be attributed two known functions of hMLH1. Here, proteins involved in cell-cycle control (ANXA6, LPP2, NDRG1, PTP4A2/RH, RAPGEFL1, SPTLC2 and ARAF1), apoptosis (CTSB, CAPN5, DDX47, DES and mitochondrial proteins) and ribosomal proteins (EIF2A, EEF2, RPS2, RPS5 und RPS16) are of special interest. Further experiments must show, which of these newly identified interaction partners of hMLH1 can possibly be used as future prognostical or predictive biomarkers. Additionally, new insights into the interaction mechanisms of MMR and cell-cycle/apoptosis could lead to new pharmacological approaches in the future.