Open Access

Uta Rabenhorst

• Proliferation and apoptosis are fundamental cellular processes that are important for the development and homeostasis of multi-cellular organisms. Deregulation of these processes plays an important role in tumor formation. Often, genes that control homeostasis by regulating proliferation and apoptosis are mutated or improperly expressed in tumors. In this project, the physiological and pathological functions of FUSE Binding Protein 1 (FBP1) were studied to elucidate the involvement of this gene in the context of embryonic development and tumorigenesis. Two reasons led to the hypothesis that FBP1 might be relevant in this context. FBP1 was isolated in the group of PD Dr. Martin Zörnig using a functional yeast survival screen for the identification of anti-apoptotic genes involved in tumorigenesis, and the anti-apoptotic function of FBP1 was confirmed in the human colon carcinoma cell line RKO. In addition, FBP1 had been published to function as a transcriptional regulator that activates expression of the proto-oncogene c-myc. This gene stimulates cell proliferation and is overexpressed in many tumors. Analysis of FBP1 expression by immunhistochemistry in normal and tumor tissue samples revealed frequent and significant overexpression of FBP1 in Hepatocellular Carcinoma (HCC). To study the functional relevance of FBP1 activity for this tumor type, apoptosis and proliferation of the HCC cell line Hep3B were studied in dependence of FBP1 expression. Downregulation of FBP1 by lentiviral expression of FBP1-specific short hairpin RNA (shRNA) reduced proliferation and increased sensitivity to apoptosis. Subcutaneous injection of FBP1-deficient Hep3B cells into immunodeficient NOD/SCID mice demonstrated that tumor growth was strongly decreased in comparison to control cells. mRNA expression studies by quantitative real time PCR showed reduced mRNA levels of the pro-apoptotic genes Bik, Noxa, TRAIL and TNF-􀀁 in the absence of FBP1. In addition, the cell cycle inhibitors p21 and p15 were repressed by FBP1 while Cyclin D2 expression was decreased in the absence of FBP1. Surprisingly, expression of c-myc was not altered by FBP1 downregulation, indicating a different mechanism of c-myc regulation in HCC cells. These results demonstrate that overexpression of FBP1 inhibits apoptosis and stimulates proliferation in HCC cells by regulating the transcription of relevant target genes. Therefore, FBP1 might represent a promising therapeutic target for the treatment of HCC. For analysis of the physiological function of FBP1, a gene trap mouse model was established. In these mice, the gene trap vector pT1􀀂geo is inserted in intron 19 of the FBP1 locus, leading to the expression of a fusion protein consisting of a truncated FBP1 (lacking the last 62 amino acids), 􀀁-Galactosidase and Neomycin Phosphotransferase. Luciferase reporter assays demonstrated that the fusion protein was not capable of activating the c-myc promoter and even showed a dominant negative effect. Thus, this gene trap mouse serves as a functional FBP1 knockout model. Phenotyping of the FBP1 gene trap mice showed that homozygous mutation of FBP1 resulted in embryonic lethality at late stages of embryonic development (E15.5-E16.5). Heterozygous mice were viable, but born at lower frequencies, indicating a gene dosage- or a dominant negative effect of the FBP1 fusion protein. The cellular effects of FBP1 inactivation were tested in mouse embryonic fibroblasts isolated from FBP1 gene trap mice. While proliferation was reduced in the absence of wildtype FBP1, apoptosis was not affected. Expression analysis showed that in homozygous MEFs p15 and p21 transcripts were upregulated, while decreased cmyc mRNA levels were measured. Closer inspection of homozygous gene trap embryos revealed an anemic phenotype that appeared most pronounced around embryonic day 15.5. Analysis of fetal livers, the main site of hematopoiesis at this stage of development, showed a strongly reduced total cell number in homozygous embryos. Evaluation of the different hematopoietic cell lineages did not reveal significant changes in particular differentiated cell types. Instead, all cell lineages seemed to be affected equally by FBP1 inactivation. In contrast, analysis of hematopoietic progenitor cell populations showed an increased percentage of multipotent progenitor cells (MPPs) and a strongly reduced number of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs). Functional analysis of MPPs by in vitro colony formation assays demonstrated that the FBP1-mutant cells possess a normal colony formation potential while their expansion capacity was reduced. Competitive transplantation of lineage negative fetal liver cells into irradiated recipient mice resulted in reduced engraftment of liverderived progenitor cells from homozygous FBP1 gene trap mice. However, stable engraftment was observed over a period of 12 weeks, demonstrating that the FBP1-deficient LT-HSCs are in principle capable of long-term repopulation. These results demonstrate that FBP1 exerts an essential function during definitive hematopoiesis. It can be speculated that FBP1 influences proliferation, apoptosis and possibly also stem cell self-renewal through the regulation of specific target genes within the hematopoietic progenitor cells. Alternatively, extrinsic effects caused by the absence of FBP1 activity could impair the function of the progenitor cells.
• Die genaue Regulation von Zellproliferation und programmiertem Zelltod (Apoptose) sind von herausragender Bedeutung für die Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen. Laufen diese Prozesse unkontrolliert ab, kann dies zur Entstehung von Krankheiten und zum Tod des Organismus führen. Übermäßige Proliferation und Inhibition der Apoptose beispielsweise tragen maßgeblich zur Entstehung von Tumorerkrankungen bei, und zahlreiche Mausmodelle belegen, dass die Mutation von Genen, die diese Vorgänge steuern, schwere Missbildungen verursachen können. Häufig sind dieselben Gene, die für die Embryonalentwicklung entscheidend sind, in Krebszellen mutiert oder werden in veränderter Stärke exprimiert. Im Laufe dieser Doktorarbeit wurde untersucht, ob das Protein FUSE Binding Protein 1 (FBP1) wichtig für physiologische Prozesse während der Embryonalentwicklung und für die Tumorentstehung ist. Die Vermutung, dass FBP1 eine Rolle bei diesen Vorgängen spielt, beruht auf zwei wesentlichen Hinweisen. Zum einen wurde FBP1 in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Martin Zörnig in einem funktionellen Hefe-Screen zur Identifizierung antiapoptotischer Onkogene isoliert. Seine anti-apoptotische Funktion konnte in Säugerzellen durch Überexpressions-Studien in der Kolonkarzinom-Zelllinie RKO nachgewiesen werden. Zudem war aus einigen Veröffentlichungen bekannt, dass FBP1 als Transkriptionsregulator fungiert und eine spezifische DNA-Sequenz (das FUSE Element) in der Promotor-Region des Proto-Onkogens c-myc bindet. Durch Interaktion der C-terminalen FBP1-Aktivierungsdomäne mit dem Transkriptionsfaktor TFIIH kann es den „Promoter Release“ des Transkriptionsapparates induzieren und so die Expression des Zielgens c-myc hochregulieren. Dadurch kontrolliert FBP1 beispielsweise die Proliferation und Differenzierung in Leukämie-Zelllinien. Eine verstärkte Expression von c-myc fördert die Entstehung von Tumoren und wurde bereits in zahlreichen Tumorarten als wesentliche onkogene Aktivität nachgewiesen. Weiterhin führt die Inaktivierung von c-myc in Mäusen zu embryonaler Letalität. Als erster Schritt zur Untersuchung einer potentiellen onkogenen Funktion wurde die Expressionstärke von FBP1 in Normal- und Tumorgeweben durch immunhistochemische Färbungen ermittelt. Hierbei wurde gezeigt, dass FBP1 in über 80 Prozent der untersuchten Hepatozellulären Karzinome (HCC) eine deutliche Überexpression im Vergleich zu normalem Lebergewebe aufwies. Um zu klären, ob diese erhöhte Expression lediglich mit der HCC-Entstehung korreliert oder ob sie darüber hinaus von funktioneller Relevanz ist, wurde der Einfluss von FBP1 auf das Verhalten der HCC-Zelllinie Hep3B untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit einem Lentivirus transduziert, das eine FBP1-spezifische „short hairpin“ RNA (shRNA) enthält und dadurch die Expression von FBP1 unterdrückt. Anschließende Messungen der Apoptoserate in diesen Zellen zeigten, dass die Herunterregulation von FBP1 zu einer erhöhten Sensitivität der Zellen gegenüber Apoptoseinduzierenden Stimuli (UV-Bestrahlung und Behandlung mit Mitomycin C sowie Doxorubicin) führte. Weiterhin wurde durch Bromodeoxyuridin-Inkorporation nachgewiesen, dass die Proliferation der Hep3B-Zellen in Abwesenheit von FBP1 deutlich verringert war. Die Relevanz dieser Beobachtungen für die Tumorentwicklung wurde in vivo durch subkutane Injektion der Hep3B-Zellen in immundefiziente Mäuse getestet. Es konnte gezeigt werden, dass FBP1-defiziente Tumore gegenüber Kontrolltumoren ein stark verringertes Wachstum aufwiesen. Durch histologische Untersuchungen wurde ein erniedrigter Anteil an mitotischen sowie an de-differenzierten Zellen in FBP1-defizienten Tumoren nachgewiesen. FBP1 fördert also das Tumorwachstum in vivo, indem es die Zellproliferation verstärkt und zur De-Differenzierung von Zellen beiträgt. Unterschiede in der Häufigkeit apoptotischer Zellen in den Tumoren konnten nicht nachgewiesen werden. Der Beitrag der anti-apoptotischen Funktion von FBP1 zur Tumorbildung in Xenograft-Transplantationen konnte daher nicht eindeutig belegt werden. Zur Aufklärung der Mechanismen, durch die FBP1 Apoptose, Zellproliferation und Tumorwachstum steuert, wurde die mRNA-Expression von Apoptose- und Zellzyklus-relevanten Genen durch quantitative real time PCR untersucht. Die Herunterregulation von FBP1 in Hep3B-Zellen hatte eine Erhöhung der mRNA-Menge der pro-apoptotischen Gene Bik, Noxa, TRAIL und TNF-􀀁 zur Folge. Weiterhin wurde eine verstärkte Expression der Zellzyklusinhibitoren p21 und p15 beobachtet, während die Expression von Cyclin D2 in Hep3B Zellen ohne FBP1 verringert war. Überraschenderweise wurde die mRNA-Menge von c-myc durch die fehlende FBP1-Expression nur unwesentlich verändert, was darauf hindeutet, dass die Transkription von c-myc in HCC-Zellen unabhängig von FBP1 verläuft und sich dadurch von der publizierten c-myc Regulation in Leukämie-Zelllinien unterscheidet. Weiterhin wurde bisher c-myc als einziges FBP1-Zielgen beschrieben. Die im Verlauf dieser Arbeit erhobenen Daten belegen, dass FBP1 die Expression weiterer Zielgene kontrolliert. Die Tatsache, dass einige Gene in der Abwesenheit von FBP1 stärker exprimiert wurden, lässt auf eine Funktion von FBP1 als Transkriptionsrepressor schließen. Diese Wirkungsweise könnte durch die Nterminale Domäne von FBP1 vermittelt werden, für die in Reporterassays bereits ein repressorisches Potential nachgewiesen wurde. Die Ergebnisse der mRNA-Expressionsstudien zeigen, dass FBP1 die Zellproliferation und Apoptose in HCC-Zellen durch die Repression proapoptotischer Gene sowie durch die Repression von Zellzyklus-Inhibitoren steuert. Die hier nachgewiesene funktionelle Bedeutung von FBP1 für die Tumorentwicklung macht dieses zu einem potentiellen therapeutischen Zielprotein für die Behandlung des Hepatozellulären Karzinoms. Inhibition von FBP1 könnte das Tumorwachstum verringern und die Sensitivität der Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika erhöhen, wodurch die Effektivität solcher Substanzen in Kombinationstherapien gesteigert werden könnte. Zur Analyse der physiologischen Funktion von FBP1 wurde ein „gene-trap“-Mausmodell etabliert. In diesen Mäusen führt die Integration des pT1􀀁geo-„genetrap“- Vektors in Intron 19 des FBP1-Locus zur Bildung eines Fusionsproteins, das aus einem um 62 Aminosäuren verkürzten FBP1, 􀀁-Galaktosidase und Neomycin-Phosphotransferase besteht. Durch den Verlust der letzten 62 Aminosäuren wird ein Tyrosin-reiches Aktivierungsmotiv aus der C-terminalen Domäne von FBP1 entfernt, das zur Transkriptionsaktivierung durch FBP1 beiträgt. Für die Aktivitätsbestimmung des Fusionsproteins wurden Reporterassays mit einem Plasmid durchgeführt, in dem die Expression des Luziferase-Gens durch eine 3,3 kb umfassende genomische Sequenz „upstream“ des Transkriptionsstarts für c-myc einschließlich des Promotors kontrolliert wird. In diesen Messungen zeigte sich, dass das FBP1-Fusionsprotein, im Gegensatz zu Wildtyp-FBP1, nicht in der Lage ist, die durch den c-myc-Promotor gesteuerte Transkription zu verstärken und sogar einen dominant negativen Effekt auf die Wildtyp-FBP1-Aktivität auszuüben scheint. Diese Ergebnisse zeigen, dass das FBP1-„gene-trap“-Mausmodell dazu geeignet ist, die Folgen der FBP1-Inaktivierung in vivo zu untersuchen. Bei der Verpaarung heterozygoter FBP1-„gene-trap“-Mäuse wurde festgestellt, dass keine homozygoten Nachkommen geboren wurden. Die Inaktivierung von FBP1 in diesen Tieren führte zu embryonaler Letalität während der späten Embryonalentwicklung (E15,5-E16,5). Heterozygote FBP1-„gene-trap“-Mäuse erschienen phänotypisch normal, wurden allerdings in geringeren Zahlen geboren, als nach den Mendelschen Gesetzen erwartet wurde, was auf einen „gene-dosage“-Effekt oder eine dominant negative Funktion des FBP1-Fusionsproteins hindeutet. Zur Untersuchung der Folgen der FBP1-Inaktivierung in primären Zellen wurden embryonale Fibroblasten aus FBP1-„gene-trap“-Mäusen isoliert. In diesen Zellen führte die homozygote Mutation von FBP1 zu einer verringerten Expansion in Kultur. Untersuchungen der Apoptose-Sensitivität zeigten keine Unterschiede zwischen Zellen der verschiedenen Genotypen. FBP1 scheint also, anders als in Hep3B- und RKO-Zellen, in primären Fibroblasten keinen anti-apoptotischen Effekt auszuüben. Daraus kann geschlossen werden, dass die verringerte Expansion der Fibroblasten in Abwesenheit von Wildtyp-FBP1 auf eine niedrigere Proliferationsaktivität zurückzuführen ist. Um zu klären, ob in Fibroblasten die gleichen Zellzyklusrelevanten Gene durch FBP1 reguliert werden wie in HCC-Zellen, wurden mRNA-Expressionsmessungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die Expression der Zellzyklus-Inhibitoren p21 und p15 (vergleichbar mit Hep3B-Zellen) in homozygot mutanten Zellen erhöht war. Anders als in Hep3B-Zellen war zusätzlich die Expression der c-myc-mRNA in Abwesenheit von Wildtyp-FBP1 erniedrigt, während die mRNA-Menge von Cyclin D2 konstant blieb. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass FBP1 eine Zelltyp-spezifische Funktion in der Genregulation ausübt. Die makroskopische Begutachtung von Embryonen aus Verpaarungen heterozygoter FBP1-„gene-trap“-Mäuse ergab, dass das Abdomen homozygoter Embryonen um Embryonaltag 15,5 deutlich blasser erscheint als das von Wildtyp-Tieren. Dieser Unterscheid weist auf einen anämischen Phänotyp hin, da die fötale Leber in diesem Stadium das wichtigste Organ der Hämatopoese ist und die rote Färbung des Bauchraums hauptsächlich auf die Farbe der Leber zurückzuführen ist. Nähere Untersuchungen der fötalen Leber zeigten eine stark verringerte Gesamtzellzahl dieses Organs in homozygoten Embryonen. Um zu bestimmen, ob diese Veränderung auf das Fehlen bestimmter hämatopoetischer Zelltypen zurückzuführen ist, wurden die Leberzellen mit Antikörpern gegen Zelltypspezifische Oberflächenmarker gefärbt und mit Hilfe von Durchflusszytometrie analysiert. Dabei zeigte sich, dass die Verringerung der Zellzahl alle differenzierten hämatopoetischen Zelltypen annährend gleich stark betraf. Dagegen wurden deutliche Unterschiede in den Populationen der hämatopoetischen Vorläuferzellen festgestellt. Während die Prozentzahl multipotenter Vorläuferzellen (MPPs) in homozygoten Embryonen erhöht war, wurde eine fünfundzwanzigfach verringerte Zahl an langzeit-repopulierenden hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) nachgewiesen. In heterozygoten Embryonen dagegen waren interessanterweise sowohl die Anzahl an MPPs als auch die von LT-HSCs erhöht. Die funktionelle Untersuchung der MPPs durch in-vitro-Koloniebildungsexperimente zeigte ein unverändertes Koloniebildungs-Potenzial für die verschiedenen Genotypen, während die Expansionsfähigkeit der homozygoten Zellen eingeschränkt war. Um die Funktionalität der hämatopoetischen Vorläuferzellen in vivo zu überprüfen, wurden kompetitive Transplantationen durchgeführt. Dabei wurden Vorläuferzellen aus fötalen Lebern isoliert und zusammen mit Knochenmarkszellen aus Empfängertieren in letal bestrahlte Empfängermäuse injiziert. In Mäusen, die mit homozygoten Zellen transplantiert waren, wurde eine eingeschränkte Repopulation durch die fötalen Zellen nachgewiesen, die allerdings über einen Zeitraum von 12 Wochen stabil blieb. Offensichtlich sind also die LTHSCs aus homozygoten Embryonen befähigt zur Langzeit-Repopulation, liegen aber in deutlich geringeren Zahlen in der fötalen Leber vor. Zusammen mit der eingeschränkten Expansionsfähigkeit der MPPs führt dies zur reduzierten Produktion differenzierter hämatopoetischer Zellen und zur verringerten Größe der fötalen Leber, die hauptsächlich aus hämatopoetischen Zellen besteht. In heterozygoten Embryonen können Defekte in der Bildung differenzierter Blutzellen vermutlich durch die kompensatorische Erhöhung der Menge an LT-HSCs und MPPs ausgeglichen werden, so dass die Gesamtzellzahl der fötalen Lebern der in Wildtyp-Embryonen gleicht. In homozygoten Embryonen kann der vollständige Verlust der FBP1-Aktivität dagegen nicht ausgeglichen werden und führt zu embryonaler Letalität. Diese Ergebnisse belegen, dass FBP1 eine essenzielle Funktion für die definitive embryonale Hämatopoese besitzt. Eine besondere Rolle scheint FBP1 dabei in Langzeit-repopulierenden hämatopoetischen Stammzellen zu spielen. Weiterhin beeinflusst es die Bildung der verschiedenen differenzierten Blutzelltypen aus multipotenten Vorläuferzellen. Vermutlich steuert FBP1 die Proliferation, Apoptose und Differenzierung von hämatopoetischen Zellen über die Regulation spezifischer Zielgene. Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse über die Funktionsweise von FBP1 in HCC-Zellen und im hämatopoetischen System belegen, dass FBP1 eine physiologische Relevanz bei der Steuerung von Proliferation und Apoptose zukommt und dass die pathologische Deregulation von FBP1 zur Entstehung von Tumorerkrankungen beitragen kann.