Open Access

Ellen Preuß

• Suicide genes have been broadly used in gene therapy. They can serve as safety tools for conditional elimination of infused cells or for directed tumor therapy. To date, the Herpes simplex virus thymidine kinase/ ganciclovir (HSVtk/GCV) system is the most prominent and the most widely used suicidegene/prodrug combination. Despite its promising performance, the system displays limitations, which include relatively slow killing kinetics and toxicity of the prodrug GCV. Consequently, several groups have either developed new suicide-gene/prodrug combinations or attempted to improve the established HSVtk/GCV suicide system. The present study also aimed towards optimization of the HSVtk/GCV system. To do so, a novel, codon-optimized point mutant (A168H) of HSVtk was developed. The novel mutant was named TK.007. It was extensively tested for its efficiency in two relevant settings: (1) control of severe graft-versus-host disease (GvHD) after adoptive immunotherapy with Tlymphocytes, and (2) direct elimination of targeted tumor cells. TK.007 was compared to the broadly used wild-type, splice-corrected scHSVtk and to a codon-optimized HSVtk (coHSVtk) not bearing the above point mutation. (1) For experiments related to the adoptive immunotherapy approach, HSVtkvariants were expressed from a γ-retroviral MP71 vector as a fusion construct with the selection and marker gene tCD34. Expression levels for TK.007 in transduced lymphoid and myeloid cell lines were significantly higher at initial transduction and over a 12 week period compared to the commonly used scHSVtk and coHSVtk indicating reduced toxicity of TK.007. Killing kinetics of transduced cell lines (PM1 and K562) and primary human T cells were significantly faster for TK.007 in comparison to scHSVtk and coHSVtk in vitro. In vivo-functionality of TK.007 was assessed in an allogeneic transplantation model. T cells derived from C57BL/6J.Ly5.1 donor mice were transduced with MP71 vectors expressing scHSVtk or TK.007. Transduced cells were selected and transplanted into Balb/c Rag2-/- γ-/- immune-deficient recipient mice. Acute, severe GvHD occurred and was effectively abrogated in all mice transplanted with TK.007- transduced T cells, and in five out of six mice transplanted with scHSVtk-transduced cells. In a slightly modified quantitative allogeneic transplantation mouse model, significantly faster and more efficient in vivo killing was demonstrated for TK.007 as compared to scHSVtk, especially at low doses of GCV. (2) In order to assess TK.007 functionality in cells derived from solid tumors, HSVtk-variants were expressed from lentiviral gene ontology (LeGO) vectors in combination with an eGFP/neo-opt selection cassette. Transduced and selected tumor cell lines that derived from several tissues were eliminated at significantly lower GCV doses and to higher extents when transduced with TK.007 compared to scHSVtk. Moreover, a significantly stronger bystander effect of TK.007 was demonstrated. The superior in vitro efficiency of TK.007 was confirmed in an in vivo subcutaneous xenograft mouse model for glioblastoma in NOD/SCID mice. Mice transplanted with TK.007 transduced cells stayed tumor-free after treatment with different GCV-doses. On the contrary, mice of the scHSVtk group either demonstrated only transiently reduced tumor growth in the low-dose GCV group (10 mg/kg) compared to the control groups or suffered from relatively fast relapses after initial tumor shrinking in the standarddose (50 mg/kg) GCV group. As a result, all mice in the scHSVtk group died from vigorous tumor growth. In summary, in two different applications for suicide gene therapy the present study has demonstrated superior functional performance of the novel suicide gene TK.007 as compared to the broadly used wild-type scHSVtk. Differences became particularly pronounced at low doses of GCV. It can be concluded that the new TK.007-gene represents a promising alternative to the commonly used scHSVtk for gene therapeutic applications.
• Die Suizidgentherapie zählt zu den bisher erfolgreichsten in präklinischen und klinischen Studien angewandten gentherapeutischen Strategien und beabsichtigt das spezifische Abtöten von Zielzellen in einem Patienten. Hierfür wird ein so genanntes „Selbstmordgen“ in die Zielzelle eingebracht, welches nach der Gabe eines per se nicht toxischen Agens (z.B. eines „Prodrug“) den Tod der genetisch modifizierten Zelle vermittelt. Das Herpes-Simplex-Virus-Thymdin-Kinase (HSVtk)/ ganciclovir (GCV)-system ist das bisher am besten untersuchte Suizidgensystem. Bei diesem System beruht das spezifische Abtöten der Suizidgen-modifizierten Zellen auf der geringen Substratspezifität der viralen Kinase, welche im Gegensatz zu zellulären Kinasen nicht nur zelleigene Nukleoside, sondern auch synthetische Nukleosidanaloga wie GCV als Substrate akzeptiert. Entsprechend wird GCV von der HSVtk zu ganciclovir-Monophosphat (GCV-MP) phosphoryliert, woraufhin zelluläre Kinasen die weitere Phosphorylierung zum Di- und schließlich Triphosphat (TP) katalysieren. Letzteres wird im Zuge der Replikationsphase der Mitose in den wachsenden DNA-Strang eingebaut und hat den Abbruch der DNA-Synthese, die damit verbundene Initiation der Apoptose und somit den Zelltod zur Folge. Gleichzeitig kann die zelluläre DNAPolymerase durch die Interaktion mit GCV-TP auch direkt gehemmt werden. Das HSVtk/GCV Suizidgensystem wurde bereits in einer Reihe von präklinischen und klinischen Studien auf seine Funktionalität getestet. Dabei wurde der Schwerpunkt auf zwei klinischen Anwendungen gesetzt. Die erste Anwendung bezieht sich auf die Kontrolle einer schweren Spendergegen- Wirt-Krankheit (graft-versus-host disease, GvHD). Diese kann bei einer T-Zell-vermittelten adoptiven Immuntherapie im Kontext einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT) auftreten. Die HSZT wird nach Hochdosis-Chemo- und/oder Strahlentherapie u.a. bei Patienten durchgeführt, die an malignen Erkrankungen des Blutsystems (z.B. Leukämien) leiden, um das geschädigte Blutsystem zu rekonstituieren. Die klinische Verlaufsgeschichte nach der Stammzelltransplantation machte deutlich, dass Spender-Lymphozyten im Transplantat sowohl positive als auch negative Effekte auf den Patienten ausüben können. Einerseits unterstützen sie das Anwachsen des Transplantats, fördern die Immunrekonstitution und vermögen sogar einen so genannten Spender-gegen-Leukämie-Effekt (graft-versusleukemia, GvL) auszulösen, welcher auf der Reaktivität der Spender-T-Zellen gegenüber malignen Zellen beruht, die in der Folge abgetötet werden (z.B. residuale Leukämiezellen nach Chemo-/ Strahlentherapie). Andererseits können sie auch eine GvHD verursachen. Diese Erkrankung ist eine Folge der Alloreaktivität der Spender-T-Zellen, die sich gegen gesundes Empfängergewebe richtet. Im schlimmsten Fall kann eine schwere GvHD zum Organversagen und zum Tod eines Patienten führen. Um nun eine schwere GvHD zu kontrollieren und dabei positiv wirkende Effekte der Spender-T-Zellen auf den Patienten beizubehalten, ist die Suizidgentherapie mit HSVtk/GCV ein viel versprechender Ansatz. Dabei werden die Spender-T-Zellen mit HSVtk genetisch modifiziert und anschließend in den Patienten infundiert. Im Falle einer schweren GvHD können die alloreaktiven, gemodifizierten T-Lymphozyten über GCV-Applikation selektiv abgetötet werden. Der zweite Anwendungsbereich des HSVtk/GCV-Suizidgensystems betrifft die Eliminierung solider Tumore im Patienten (z.B. Melanom, Glioblastom). Hierfür wird das HSVtk-Suizidgen in die Tumorzellen transferiert, welche dann durch anschließende GCV-Applikation abgetötet werden können. Da es eine Herausforderung ist, jede Tumorzelle mit dem Suizidgen zu versehen, spielt bei der Therapie solider Tumore der so genannte „Bystander-Effekt“ des HSVtk/GCV-Suizidgensystem eine entscheidende Rolle. Dieser beschreibt das Abtöten von nicht Suizidgen-modifizierten Zellen, die sich in enger Nachbarschaft zu modifizierten Zellen befinden. Der Mechanismus funktioniert über den Transport von GCV-MP von Suizidgen-modifizierten Zellen über Gap- Junctions in benachbarte nicht-modifizierte Zellen und führt hier über die weitere Verstoffwechselung zum Zelltod. Trotz breiter Anwendung ist das HSVtk/GCV-Suizidgensystem auch mit Limitationen verbunden. So erfolgt das Abtöten von Zielzellen vergleichsweise langsam - der maximale Effekt benötigt ca. 4-6 Tage in vitro und mehr als 6 Tage in vivo. Darüber hinaus wirkt GCV in den für den Suizidgenansatz angewandten relativ hohen Dosen toxisch, ins besondere auf die Myelopoese. Weitere bei einigen Anwendungen potentielle Nachteile betreffen die Restriktion des Wirkmechanismus auf sich teilende Zellen sowie die Immunogenität von HSVtk. Aufgrund der Limitationen des HSVtk/GCV-Systems wurde eine Reihe alternativer Suizidgensysteme entwickelt und getestet, ohne dass dabei bisher wesentliche Durchbrüche beschrieben werden konnten. Andere Arbeiten verfolgten das Ziel, das etablierte HSVtk/GCV-Suizidgensystem zu verbessern. Die wichtigste Strategie bestand darin, verschiedene HSVtk-Mutanten zu generieren, die eine erhöhte Affinität der Kinase gegenüber ihrem Substrat GCV zeigten. Damit sollte ein effizienteres Abtöten von Zielzellen unter geringeren GCV-Dosen erreicht werden. Auch die vorliegende Arbeit widmete sich der Aufgabe, das beschriebene HSVtk/GCV-Suizidgensystem im Hinblick auf verschiedene gentherapeutische Anwendungen zu optimieren. Dazu wurde eine HSVtk-Variante untersucht, die auf einer bereits in der Literatur beschriebenen HSVtk-Mutante (HSVtkA168H) basiert. Diese zeigte eine im Vergleich zur Wildtyp HSVtk verminderte Affinität zum zellulären Substrat Desoxythymidin (dThd) und gleichzeitig eine vollständig erhaltene Affinität zu GCV. In dieser Arbeit wurde die Funktionalität der beschriebenen Mutante im Hinblick auf die oben beschriebenen therapeutischen Ansätze evaluiert. Um die Expression der HSVtk(A168H) zu verbessern, wurde diese zusätzlich kodonoptimierte (co). Die neue HSVtk-Variante erhielt den Namen TK.007. TK.007 wurde im Vergleich zur konventionell eingesetzten spleiß-korrigierten (splicecorrected (sc)), Wildtyp HSVtk (scHSVtk) und einer vollständig kodonoptimierten, jedoch nicht mutierten HSVtk-Variante (coHSVtk) untersucht. Der erste Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die T-Zell-vermittelte adoptive Immuntherapie. In einem ersten Versuch wurde die Expression und Abtötungsaktivität der verschiedenen HSVtk-Varianten in Zellen des hämatopoetischen Systems evaluiert. Hierfür wurden je eine der drei HSVtk- Varianten (scHSVtk, coHSVtk, TK.007) mit der als Marker- und Selektionsgen benutzten, verkürzten (truncated (t)) Variante des Oberflächenantigens CD34 fusioniert. Die drei Fusionsgene wurden jeweils in den γ-retroviralen MP71- Vektor kloniert (MP71-tCD34/scHSVtk; MP71-tCD34/coHSVtk; MP71- tCD34/TK.007). Diese Vektoren wurden benutzt, um lymphoide (PM1) und myeliode (K562) Zellinien sowie primäre humane T-Zellen zu transduzieren. Das Expressionsniveau von TK.007 war in allen untersuchten Zellen am höchsten und die erhöhte Expression wurde über einen 12-wöchigen Zeitraum beibehalten. Transduzierte Zellen wurden über magnetische Zellsortierung (Magnetic Cell Sorting, MACS) mit an α-CD34 gekoppelten immunobeads selektioniert. Dies war für alle drei HSVtk-Varianten mit hoher Reinheit möglich. Selektionierte Kulturen von transduzierten Zellen wurden mit GCV über eine Woche behandelt und auf dieser Basis Inhibitionskinetiken erhoben. Eine signifikant erhöhte Funktionalität von TK.007 konnte für alle untersuchten Zellarten gezeigt werden. Um die erhöhte Funktionalität von TK.007 auch in vivo im Kontext der Abrogation einer schweren GvHD zu zeigen, wurde ein allogenes Transplantationsmodell benutzt, welches auf der Transplantation primärer muriner T-Zellen von C57BL/6J.Ly5.1-Mäusen in immundefiziente Balb/c Rag2-/- γ-/--Mäuse beruht: Die aus Lymphknoten und Milz der C57BL/6J.Ly5.1-Mäuse isolierten T-Zellen wurden in vitro stimuliert und daraufhin mit MP71- tCD34/scHSVtk oder MP71-tCD34/TK.007 transduziert. Die Transduktionsrate lag hierbei unter 30%, um nur eine Vektorintegration pro Zelle zu gewährleisten. Die transduzierten Zellen wurden über MACS selektioniert und intravenös in Balb/c Rag2-/- γ-/- Mäuse transplantiert. Alle transplantierten Mäuse entwickelten eine akute GvHD, welche über das Auftreten verschiedene Symptome (Aktivitätsverlust, struppiges Fell, Durchfall, Gewichtsverlust zu mehr als 10%) definiert wurde. Die akute GvHD konnte in 6 von 6 Mäusen in der TK.007- Kohorte und 5 von 6 Mäusen in der scHSVtk-Kohorte, durch Applikation einer geringen GCV-Dosis (10mg/kg) einmal pro Tag über drei Tage geheilt werden, was sich unter anderem durch eine schnelle Gewichtszunahme äußerte. Zwei von sechs Mäusen in beiden Kohorten verblieben ohne Rückfälle (Rezidive), während alle anderen Mäuse GvHD-Rezidive entwickelten. Vermutlich erfolgten die Rezidive aufgrund der geringen eingesetzten Dosis GCV und der kurzen Behandlungsdauer. Dieses Experiment bewies eine generelle in vivo- Funktionalität von TK.007. Um nun auch mögliche quantitative Unterschiede zwischen TK.007 und scHSVtk in vivo zu evaluieren, wurde das oben beschriebene Mausmodell modifiziert. Anstatt die Spender-T-Zellen zu selektionieren, wurden diese mit einer Transduktionsrate von ca. 50% transplantiert. So konnte ein Abfall der transduzierten Zellen nach GCVApplikation im peripheren Blut der Mäuse anhand der tCD34-Expression unmittelbar quantitativ bestImmt werden. Die GCV-Behandlung erfolgte fünf Tage nach Transplantation, d.h. bevor eine GvHD eintrat über einen Zeitrum von fünf Tagen. Mit diesem quantitativen Mausmodell wurde eine signifikant erhöhte Aktivität von TK.007 im Vergleich zu scHSVtk in vivo gezeigt werden, die bei geringen Dosen an GCV besonders ausgeprägt war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Funktionalität von TK.007 im Hinblick auf die Therapie solider Tumoren untersucht. Dabei wurde zuerst die in vitro-Aktivität von TK.007 im Vergleich zu scHSVtk und coHSVtk in verschiedenen Tumorzellinien (Glioblastom, Lungenkarzinom, Melanom, Kolonkarzinom) untersucht. Die Zellinien wurden mit lentiviral gene ontology Vektoren (LeGOVektoren) transduziert, die für eine der drei HSVtk-Varianten sowie ein Fusionsgen aus eGFP und Neomycin-Resistenz kodierten (LeGO-iG2/neo-optscHSVtk oder -coHSVtk oder -TK.007). Transduzierte Zellen konnten auf dieser Grundlage effizient über G418-Applikation selektioniert werden. Anschließend wurden sie einmalig mit unterschiedlichen GCV-Konzentrationen (Bereich von 10nm bis10mM) behandelt, und nach drei Tagen wurde die Rate der lebenden Zellen mittels MTT-Assay bestimmt. In allen untersuchten Tumorzellinien zeigten TK.007-transduzierte Zellen eine erhöhte absolute Inhibitionsrate im Vergleich zu scHSVtk- oder coHSVtk-transduzierten Zellen. Außerdem konnte in Mischkulturen von transduzierten und nicht-transduzierten Zellen nach GCV Applikation ein erhöhter Bystander-Effekt von TK.007 im Vergleich zu scHSVtk nachgewiesen werden. In einem nächsten Schritt wurde die Funktionalität von TK.007 in einem subkutanen Xenograft-Tumormodell in der Maus untersucht. Hierfür wurden transduzierte (LeGO-iG2/neo-opt-scHSVtk oder LeGO-iG2/neo-opt-TK.007) und selektionierte Glioblastomzellen (G62) subkutan in die Flanken von NOD/SCIDMäusen injiziert. Die Mäuse wurden 14 Tage nach Tumorinjektion über fünf Tage täglich mit einer standardmäßigen (50mg/kg) oder einer niedrigen (10mg/kg) GCV-Dosis behandelt. Tumore der Mäuse aus der TK.007-Kohorte verkleinerten sich unabhängig von der applizierten GCV-Dosis nach der Behandlung bis zu ihrem vollständigen Verschwinden. Diese Mäuse überlebten ohne Anzeichen von Tumoren über einen Beobachtungszeitraum von mehr als vier Monaten. Im Gegensatz dazu trat in der scHSVtk-Kohorte (50mg/kg) zwar eine starke Verringerung des Tumorvolumens auf, jedoch erlitten alle Tiere Rezidive und mussten aufgrund starken Tumorwachstums getötet werden (79-81 Tage nach G62-Injektion). Der Unterschied zwischen den beiden HSVtk-Varianten wurde in der scHSVtk-Kohorte mit geringer (10mg/kg) GCVApplikation noch deutlicher. Bei letzteren Mäusen konnte nur eine minimale Verringerung der Tumorgröße festgestellt werden und sie mussten aufgrund eines heftigen Tumorwachstums nur kurz nach (Tag 44-45 nach Injektion) den Mäusen der Kontrollgruppe (PBS-Behandlung) (Tag 29-33) getötet werden. Zusammenfassend konnte in zwei wichtigen therapeutischen Ansätzen, nämlich der adoptiven Immuntherapie sowie der Therapie solider Tumore, gezeigt werden, dass TK.007 eine erhöhte Funktionalität im Vergleich zu konventionell eingesetztem Wildtyp scHSVtk aufwies. Die erhöhte Funktionalität wurde besonders bei geringen GCV-Dosen deutlich. Mit TK.007 wurde somit eineneue HSVtk-Variante entwickelt, die eine Reihe viel versprechender Vorteile für unterschiedliche klinische Anwendungen aufweist. Es lässt sich der Schluss ziehen, dass das Ziel der vorliegenden Arbeit, welches in der Optimierung des bestehenden HSVtk/GCV Suizidgensystems bestand, in vollem Umfang erreicht werden konnte.