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Eva Biegel

• This thesis is based on the following publications (in chronological order): 1. Biegel, E., S. Schmidt & V. Müller (2009) Genetic, immunological and biochemical evidence for a Rnf complex in the acetogen Acetobacterium woodii. Environ. Microbiol. 11: 1438-1443. My contribution: Amplification, sequence determination and analysis of Rnf homologues, enrichment of the Rnf complex 2. Biegel, E. & V. Müller (2010) Bacterial Na+-translocating ferredoxin:NAD+ oxidoreductase. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 107: 18138-18142. My contribution: I designed and performed all experiments shown and interpreted the data. 3. Biegel, E., S. Schmidt, J. Gonzáles & V. Müller (2010) Biochemistry, evolution and physiological function of the Rnf complex, a novel ion-motive electron transport complex in prokaryotes. Cell. Mol. Life Sci., in press. DOI: 10.1007/s00018-010-0555-8. My contribution: I was involved in writing all chapters except chapters: „phylogenetic analyses of rnf genes“ and „distribution of rnf genes“. 4. Biegel, E. & V. Müller (2010) A Na+-translocating pyrophosphatase in the acetogenic bacterium Acetobacterium woodii. J. Biol. Chem., in press. DOI: 10.1074/jbc.M110.192823. My contribution: I designed and performed all experiments shown and interpreted the data.
• Als acetogene Bakterien werden Prokaryonten bezeichnet, die CO2 als terminalen Elektronenakzeptor nutzen und dabei Acetat als überwiegendes Stoffwechselendprodukt generieren. Anaerobe, acetogene Bakterien sind in der Natur ubiquitär verbreitet und stellen ein essentielles Glied der anaeroben Nahrungskette dar. Das von ihnen produzierte Acetat wird von methanogenen Archäen zu Methan und Kohlendioxid umgesetzt, das in die Atmosphäre entweicht und damit den Kohlenstoffkreislauf schließt. Acetogene Bakterien sind stoffwechselphysiologisch sehr divers und können chemoorganoheterotroph auf Hexosen wie Glukose oder Fruktose wachsen, C2 und C1-Verbindungen als Substrate nutzen, aber auch chemolithoautotroph durch CO2-Reduktion zu Acetat mit H2 als Elektronendonor wachsen. Trotz ihrer Entdeckung schon im Jahr 1932 und auch nach der Entschlüsselung des CO2-Reduktionsweges (Wood-Ljungdahl-Weg) zu Acetat blieb der Mechanismus, über den diese ökologisch so wichtige Gruppe von Bakterien Energie konserviert, verborgen. Über Substratkettenphosphorylierung ist im Wood-Ljungdahl-Weg keine Netto-Energiekonservierung möglich, da zwar ein ATP in der Acetat-Kinase-Reaktion generiert wird, jedoch ein ATP in der Formyl-THFSynthetase-Reaktion verbraucht wird. Dies lässt auf einen chemiosmotischen Mechanismus der Energiekonservierung schließen. Seit ca. 20 Jahren ist bekannt, dass das acetogene Bakterium Acetobacterium woodii die CO2-Reduktion zu Acetat in der Tat mit dem Aufbau eines Na+-Potentials über der Cytoplasmamembran koppelt, die Natur des Na+-translozierenden Enzyms konnte jedoch nicht enthüllt werden. Vor wenigen Jahren erfolgte eine Wende. Nach der Entdeckung, dass A. woodii Caffeat (Abbauprodukt von Lignin) an Stelle von CO2 als alternativen Elektronenakzeptor nutzen kann, wurde der Weg der Elektronen im Zuge dieser anaeroben Atmung untersucht und schließlich kürzlich aufgeklärt. Es konnte experimentell gezeigt werden, dass die Wasserstoffabhängige Caffeat-Reduktion ebenfalls zum Aufbau eines Na+-Gradienten und damit gekoppelter ATP-Synthese führt. Es wurde postuliert, dass das Na+-pumpende Enzym Elektronen vom reduzierten Ferredoxin (produziert durch die lösliche Hydrogenase) akzeptiert, in einer exergonen Reaktion auf NAD+ überträgt und die freiwerdende Energie genutzt wird, um dabei Na+ über die Cytoplasmamembran zu translozieren. Eine Ferredoxin:NAD+-Oxidoreduktase-Aktivität konnte an Membranen von A. woodii gemessen werden. Alle weiteren Komponenten des Caffeat-Reduktionsweges wurden als lösliche Enzyme identifiziert und sind somit nicht am Aufbau des Na+-Gradienten beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden invertierte Membranvesikel von A. woodii genutzt, um die Frage zu adressieren, ob der Elektronentransfer von reduziertem Ferredoxin auf NAD+ mit einem Na+-Transport in das Vesikellumen gekoppelt ist. Oxidation von reduziertem Ferredoxin, mit gleichzeitiger Reduktion von NAD+, führte in der Tat zur Akkumulation von 22Na+ im Lumen der invertierten Vesikel. Der Na+-Transport war strikt an die enzymatische Reaktion gekoppelt und abhängig von der Na+-Konzentration. Der Transport von Na+ ging mit dem Aufbau eines elektrischen Feldes einher und die Akkumulation von Na+ wurde durch Na+-Ionophore aber nicht durch Protonophore gehemmt, was darauf schließen lässt, dass ein primärer Na+-Gradient durch Fno erzeugt wird. Durch den Einsatz des ATP-Synthase Inhibitors DCCD konnte die Akkumulation von Na+ stimuliert werden. Die Experimente weisen zudem darauf hin, dass Li+ anstelle von Na+ durch den Komplex transloziert werden kann. Diese Untersuchungen enthüllen nicht nur die erste, an den Stoffwechsel gekoppelte Ionenpumpe in acetogenen Bakterien überhaupt, sondern zeigen auch zum ersten Mal, dass der exergone Elektronenfluss von Ferredoxin (-500 mV) auf NAD+ (-320 mV) mit dem Aufbau eines elektrochemischen Ionengradienten über der Membran einhergeht. Im Lichte des Stoffwechsels vieler anaerober Mikroorganismen und der Bedeutung von Ferredoxin als Elektronenüberträger in diesen Organismen impliziert diese Entdeckung, dass auch andere Mikroorganismen diese Ionen-translozierende Elektronentransportkette zur Energiekonservierung nutzen können. Die Natur der Ferredoxin:NAD+-Oxidoreduktase wurde anschließend adressiert. Nach partieller Reinigung des Enzyms durch die Verfolgung der Fno-Aktivität und der Identifizierung der Untereinheiten stellte sich heraus, dass diese ähnlich sind zu Untereinheiten des so genannten Rnf-Komplexes, ein postulierter, membrangebundener, Ionen-translozierender Elektronentransferkomplex, von dem in der Literatur vermutet wird, dass er den exergonen Elektronenfluss von Ferredoxin auf NAD+ mit dem Aufbau eines transmembranen, elektrochemischen Ionenpotentials (Na+ oder H+) koppelt. Diese Vermutung basiert auf der Verwandtschaft einiger Untereinheiten des Rnf-Komplexes zu Untereinheiten der Na+-translozierenden NADH:Chinon-Oxidoreduktase (Nqr). Eine biochemische Unterstützung für diese These war aber bisher nicht vorhanden. In dieser Arbeit durchgeführte Inhibitorstudien am angereicherten Enzym führten zur Identifizierung von Fno/Rnf-spezifischen Hemmstoffen, die zum Teil gegen die postulierten Kofaktoren des Komplexes gerichtet sind: AgNO3, CuSO4, 1,10-Phenantrolin (Eisen-Chelator), Diphenyliodonium-Chlorid und Diphenyleniodonium-Chlorid (Flavoprotein-Inhibitoren). Diese Hemmstoffe brachten ebenfalls den Fno-vermittelten Na+-Transport zum Erliegen, was darauf schließen lässt, dass die Fno-Aktivität sehr wahrscheinlich vom Rnf-Komplex katalysiert wird. Fno-Aktivität und Na+-Transport waren nur unter anaeroben Bedingungen messbar, was auf einen sauerstofflabilen Komplex hinweist. Mit Hilfe heterologer Primer (basierend auf der Gensequenz von rnfC aus Clostridium tetani) wurde ein rnfC-ähnliches Gen in A. woodii identifiziert und die Sequenz stromaufwärts und stromabwärts durch Amplifikation über inverse PCR und anschließende Sequenzierung bestimmt. Dies führte zur Entdeckung eines polycistronischen Operons: rnfCDGEAB. Durch die im Genom abgeleiteten Daten gelang dann die Konstruktion eines Arbeitsmodells zur möglichen Untereinheitenzusammensetzung und Topologie des Rnf-Komplexes. Gleichfalls wird ein Modell zur Energetik des Elektronenflusses diskutiert. Der Rnf-Komplex stellt die erste primäre Ionenpumpe in A. woodii dar und seine Rolle in der Caffeat-Reduktion wie auch im Wood-Ljungdahl-Weg wird in dieser Arbeit diskutiert. Mit Hilfe bioinformatischer Methoden wurden die rnf-Gene in über 200 Genomen bakterieller und archäeller Spezies gefunden. In einer umfangreichen Arbeit wurden Szenarien für die physiologische Funktion des Rnf-Komplexes in unterschiedlichen aeroben und anaeroben Mikroorganismen aufgezeigt. Dadurch gibt es neue Impulse für das Verständnis der Bioenergetik diverser Bakterien, aber auch der methanogenen Archäen. Neben dem Rnf-Komplex wurde in dieser Arbeit ein zweites Na+-translozierendes Enzym in A. woodii entdeckt. Wie zuvor beschrieben, führten enzymatische Messungen und Transportanalysen zum Nachweis einer membrangebundenen, Na+-translozierenden Pyrophosphatase in A. woodii. Zunächst wurde eine PPi-Hydrolyse an Membranen gemessen; diese war abhängig von der Na+-Konzentration und der PPi-Menge im Versuchsansatz. PPi-Hydrolyse führte im invertierten Membranvesikelsystem zur Anreicherung von 22Na+ im Lumen. Die Akkumulation wurde von Na+-Ionophoren verhindert, jedoch von Protonophoren nicht beeinflusst, was auf den Aufbau eines primären Na+-Gradienten durch die Pyrophosphatase hindeutet. Im Genom von A. woodii konnte ein Gen identifiziert werden, dass eine membrangebundene Pyrophosphatase kodieren könnte. Weiterhin konnten zwei Gene identifiziert werden, die lösliche Pyrophosphatasen kodieren könnten. Pyrophosphat entsteht in der Caffeat-Reduktion bei der Aktivierung des Caffeats zu Caffeyl-CoA durch die Caffeyl-CoA-Synthetase. Weiterhin fällt Pyrophosphat im Stoffwechsel in zahlreichen anabolen Reaktionen, wie der Synthese von DNA/RNA, Polysacchariden und Aminosäuren an. Somit könnte die Pyrophosphatase neben der Caffeat-Reduktion auch im anabolen Stoffwechsel von A. woodii eine Bedeutung haben. Zusammenfassend sind die in dieser Arbeit erhobenen Befunde der erste Schritt in Richtung der Lösung des Rätsels, wie die CO2-Reduktion zu Acetat mit der Energiekonservierung in acetogenen Bakterien einhergeht. Die Identifizierung einer membrangebundenen Na+-translozierenden Ferredoxin:NAD+-Oxidoreduktase strahlt weit über das Untersuchungsobjekt hinaus und spielt aufgrund der weiten Verbreitung wahrscheinlich eine Rolle in der Energiekonservierung vieler Mikroorganismen.