Prediction of biological membrane penetration of poorly soluble drugs using surface activity profiling

  • Since combinatorial chemistry and high throughput screening have become a common technique in the drug discovery phase the number of compounds being considered has increased frequently. These structures are often characterized by high molecular weight, high lipophilicity and low solubility in aqueous and physiological media. Due to the generally poor bioavailability, new in vitro techniques were needed for screening of pharmacokinetic properties. An important parameter for these screening methods is the implementation at an early state of drug discovery phase, to find potential lead structures, before investment costs become significant. The established in vitro methods for the prediction of membrane interaction are not reliable especially for poorly soluble compounds. A new method that is fast and easy to use, requires only small amounts of NCE and which can provide more reliable predictions is needed. In this study, a new screening technique based on surface activity profiling for the prediction of oral drug absorption was evaluated with special emphasis on the predictability of biological membrane interaction of poorly soluble drug compounds. It was demonstrated that drug absorption through a bilayer membrane can be modeled by the orientation of compounds at the air/water interface. Thus amphilicity of a drug is generally related to both oral absorption and blood brain barrier penetration. In turn, amphiphilicity is influenced by the lipophilicity, size and charge distribution of a drug. Surface activity profiling was determined by analysis of surface pressure profiles using the Gibbs adsorption isotherm. The surface activity measurements were carried out using a multichannel tensiometer Delta 8, which was developed by Kibron to be utilized in conjugation high throughput screening in early drug discovery processes. For this study two test sets were analyzed, one for the prediction of gastrointestinal wall interaction and the second for the prediction of the penetration behavior at the blood brain barrier. Both test sets consist of drug compounds with a wide range of absorption properties and consist mainly of compounds with poor water solubility. Since the drugs characteristics varied, they were classified according to water solubility and surface activity and a sample preparation method for each group was established. For the prediction of oral drug absorption, three different methods were established to model the interaction of compound and gastrointestinal wall. For drug compounds with solubility above 1mmol/L the traditional shake-flask method enabled the determination of the amphiphilic properties of drug compounds in pure aqueous media. Compounds with solubility below 1mmol/L tend to not to exhibit any increase in surface activity. Thus surface tension measurements of compounds, which exhibited a limited surface activity due to poor aqueous solubility, were conducted from stock solutions prepared with various organic solvents. Mainly polar organic solvents were used. A mixture of DMSO and DMF resulted in the best combination of properties: the intensive solubility enhancing effect of DMF and the lower intrinsic surface activity of DMSO. The polar solvent ruptured the water clusters, so that highly lipophilic structures had a higher affinity to the solvent and higher concentrations could be obtained. For these compounds higher maximum surface pressure were generated than was possible in pure aqueous media. The surface pressure data were correlated with the fraction absorbed values in vivo. However it was found that poor water solubility is not the only limiting step to exhibiting any surface activity. Some compounds were showed no surface activity in either solvent system. Therefore a micelle vehicle method was established using short chain phospholipids to mimic the gastrointestinal wall. It could be concluded from the results, that non surface active drugs can interact with the phospholipids micelle vehicle in a way analogous to their interaction with the membrane bilayer. The relative critical micelle concentration was correlated with the fraction absorbed of this test set. A sample preparation schema based on the three types of drugs was established. This schema enabled us to predict the absorbance of slightly soluble and poorly soluble drugs with acceptable reliability for early compound screening. For the prediction of blood brain barrier penetration using surface activity profiling as analyzing method, a test set with very poorly soluble characteristics was chosen. The sample preparation method was based on a strictly aqueous approach using the ‘shake flask’ method. The surface tension measurements enabled correlation of the amphiphilic properties of the very poorly soluble drug compounds with BBB uptake. From the aqueous surface pressure profiles and the determination of physicochemical parameters, it was found that blood brain barrier is more likely when a drug provides a small cross-sectional area, As, at the interface. The cross-sectional area is the only parameter which is independent from the maximal concentration in aqueous media and it is particularly suitable for lower solubility compounds. In summary, it was shown that amphilicity is related to biological membrane interaction in the human body and that surface activity profiling with appropriate sample preparation can be used as a reliable screening tool for the prediction of oral drug absorption of poorly soluble drugs. Furthermore an in vitro screening method of blood-brain-barrier penetration was established.
  • Die Entdeckung und Entwicklung potentieller neuer pharmazeutisch wirksamer Substanzen stellt heute einer der größten Herausforderungen forschender Pharmaunternehmen dar. Der Einsatz von kombinatorischer Chemie und das Fragmentscreening mit Hilfe von Hochdurchsatzmethoden (HTS) führen zu einer sehr großen Anzahl an möglichen Wirkstoffkandidaten, die hinsichtlich ihrer in vitro Rezeptoraffinität selektioniert werden. Diese Kandidaten zeichnen sich durch eine sehr hohe Affinität zu den entsprechenden Rezeptoren aus. Allerdings erfüllen viele der potentiellen Wirkstoffkandidaten aufgrund unzureichender biopharmazeutischer (ADME - Absorption, Verteilung, Metabolismus und Eliminierung) und/oder toxikologischer Aspekte ihre in vivo Wirkung nicht, und erreichen somit keinen therapeutischen Effekt. Verschiedene mögliche Ursachen werden diskutiert, meist hängt die nicht ausreichende Konzentration am Wirkort mit einer unvollständigen Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt zusammen. Hinzu kommt, dass durch ihre hohe Lipophilie und geringen wässrigen Löslichkeiten nur eine sehr geringe Konzentration der Substanzen in die systemische Zirkulation gelangt. Denn nur gelöste Moleküle können die Membranen penetrieren. Neben der Vorhersage des Verhaltens potentieller Substanzen an der Darmwand zur Bestimmung der oralen Bioverfügbarkeit ist das Verständnis für deren Verhalten an der Blut-Hirn-Schranke ein entscheidender Parameter für den Drug Discovery Prozess. Zentral wirksame Substanzen müssen die Blut-Hirn-Schranke überwinden, um den Wirkort zu erreichen, wo hingegen peripher wirksame Substanzen beim Übertritt in das Zentralnervensystem oder in das Gehirn zentralnervöse und toxische Nebenwirkungen hervorrufen können. Ein Abbruch in späten klinischen Phasen der Entwicklung sollte jedoch vermieden werden, da zu diesem Zeitpunkt bereits hohe Investitionen getätigt wurden. Aus diesem Grund besteht großes Interesse daran, zuverlässige in vitro Testsysteme zu entwickeln, welche eine frühzeitige Identifizierung viel versprechender Wirkstoffkandidaten mit hinreichenden biopharmazeutischen und pharmakokinetischen Eigenschaften ermöglicht und Verbindungen mit ungünstiger Pharmakokinetik eliminiert. Da dieses Screening zu Beginn der Wirkstoffentwicklung wesentlich zur Unterstützung der Wirkstoffoptimierung beitragen kann, sollte eine zuverlässige Methode entwickelt werden, die eine verlässliche Vorhersage pharmakokinetischer Eigenschaften erlaubt ohne große Mengen der zu prüfenden Substanz einzusetzen zu müssen. Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, ein solches in vitro Testsystem zu entwickeln, welches in der Lage ist, frühzeitig eine Aussage über das Maß der Resorption von schwerlösliche Arzneistoff aus dem Magen-Darm-Trakt zu treffen, sowie das Vermögen der Penetration über die Blut-Hirn-Scharanke vorherzusagen. In dieser Studie werden die Absorptionseigenschaften von möglichen Wirstoffkandidaten an der Wasser-Luft-Grenzfläche (Surface Activity Profiling, SAP) zur Vorhersage der Interaktion mit biologischen Membranen untersucht. Sie konzentriert sich dabei auf passive Resorptionsvorgänge an biologischen Membranen, wobei eine ganzheitlicher Betrachtung mit Einbezug von aktiver Resorptionsmechanismen, Efflux-Vorgänge und Metabolismus nicht berücksichtigt werden können. Die Anlagerung an die Wasser-Luft-Grenzfläche kann als vereinfachtes Modell zur Vorhersage von Resorptionsvorgängen an Zellmembranen angesehen werden. Hierbei nutzt man die die Eigenschaft amphiphiler Moleküle, von einem Medium mit höherer Polarität in ein Medium mit niedrigerer Polarität zu diffundieren, welche sich in den ähnlichen Polaritätsniveaus der Dielektrizitätskonstanten von Wasser zu Luft (E=2 Wasser/ E=80 Luft) und von physiologischen Körperflüssigkeiten zum Zellmembraninneren widerspiegelt. Für die Anlagerung der Substanzen an der Grenzfläche sind Lipophilie, Löslichkeit und räumliche Anordnung genauso entscheidend wie bei Absorptionsvorgängen an biologischen Membranen. Die Amphiphilie einer Substanz stellt die Vorraussetzung dar, dass sich ein Wirkstoff an der Wasser-Luft-Grezfläche anlagert und mit Membranen interagieren kann. Dabei sind hydrophile Eigenschaften im Wesentlichen für die Löslichkeit in biologischen Medien erforderlich, wohingegen die Lipophilie das Penetrationsvermögen einer Substanz beeinflusst. Neben solchen Substanzen gibt es aber auch Wirkstoffe, welche diese Eigenschaft nicht besitzen aber dennoch einen physiologische Effekte erzielen. Diese amphiphilen Substanzeigenschaften eines potentiellen Wirkstoffes werden mit Hilfe der Oberflächenspannung und der Auswertung von Oberflächenspannungs-/Konzentrationsprofilen bestimmt. Durch die Auswertung der Profile können verschiedene Parameter, wie die maximale Oberflächenaktivität, der Wasser-Luft-Verteilungskoeffizient, die molekulare Durchschnittsfläche eines Moleküls an der Wasser-Luft-Grenzfläche sowie die kritische Micell-Bildungskonzentration (CMC) bestimmt werden. Die Oberflächenspannung wurde mit Hilfe eines Mikrotensiometers (Delta-8, Kibron Inc) ermittelt. Dieses Tensiometer basiert auf einer modifizierten Du-Noüy Ringmethode, welche sich durch sehr schnelle automatische Messung eines Oberflächenspannungs/Konzentrationsprofils bei geringem Substanzverbrauch auszeichnet. Somit ist das Gerät zum Einsatz in der frühen Arzneistoffentwicklung geeignet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die SAP-Methode zur Vorhersage von Resorptionsvorgängen schwerlöslicher Arzneistoffe durch die Darmwand und die Penetration über die Blut-Hirn-Schranke herangezogen werden kann. Für beide Fragestellungen wurde jeweils eine Gruppe von Substanzen ausgewählt, welche sich durch ein breites Spektrum an physico-chemischen Eigenschaften auszeichnen und deren Absorptions- bzw Verteilungseigenschaften durch in vivo Daten belegt sind. Bei der Bestimmung der intestinalen Permeabilität mittels SAP in physiologischen Pufferlösungen zeigte sich, dass einige der Substanzen aufgrund ihrer geringen Löslichkeit in wässrigen Medien nicht in ausreichender Konzentration vorliegen, um eine Oberflächenaktivität aufzuweisen, weshalb für die Bestimmung der Absorptionseigenschaften der Wasser-Luft-Grenzfläche dieser Arzneistoffe verschiedene Lösungsvermittler getestet wurden. Der Zusatz einer Mischung aus Dimethylsulfoxide (DMSO) und Dimethylformamid (DMF) in einem Verhältnis 1:1 erwies sich als eine gute Kombination. DMSO hat selbst eine geringe Oberflächenaktivität und beeinflusst das wässrige Puffermedium nur gering, wohingegen DMF bessere lösungsvermittelnde Eigenschaften zeigt, dabei allerdings die Oberflächenaktivität des Mediums deutlich reduziert. Durch die Kombination der beiden Lösungsmittel konnten die unzureichenden Eigenschaften reduziert und eine logarithmische Korrelation der resorbierten Fraktion und des maximalen Oberflächendrucks mit ausreichender Genauigkeit von r² = 0.74 bestimmt werden. Es stellte sich jedoch heraus, dass eine Gruppe von Substanzen auch bei ausreichender Löslichkeit unzureichende amphiphile Molekühleigenschaften erkennen ließ. Diese Substanzen können sich nicht selbst an der Wasser-Luftgrenzfläche anlagern, haben aber dennoch in vivo die Fähigkeit die Darmwand zu überwinden. Es wurde daher eine weitere Methode entwickelt, die auf dem Einsatz von selbst sehr stark oberflächenaktiven Phospholipiden basiert. Die Arzneistoffe mit geringer eigener Oberflächenaktivität werden in einer kurzkettigen Phiospholipidlösung kolloidal gelöst und reduzieren durch die Wechselwirkung mit den Phospholipidmolekülen deren CMC. Die Verschiebung der CMC zu niedrigeren Werten und die dadurch entstandenen Differenz konnten mit den in vivo Fraktion absorbiert (FA [%]) Daten korreliert werden. Die Korrelation ergibt, dass die nicht amphiphilen Arzneistoffe die Tendenz aufweisen, stärker mit den Phospholipiden in Wechselwirkung zu treten, auch stärker mit den Phospholipiden in der Darmwand agieren. Je größer die Differenz der CMCs und desto kleiner der Wert der relativen CMC, desto größer ist das Resorptionsvermögen über die Darmwand. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Entscheidungsschema erstellt, welches neben der Vorhersage von gut wasserlöslichen Wirkstoffen mit einer Konzentration von über 1mmol/L, schwer wasserlöslichen Wirkstoffen mit Hilfe des Zusatzes von DMSO/DMF bei Substanzen mit einer Löslichkeit <1mmol/L, sowie von nicht amphiphile Moleküle durch Verwendung von oberflächenaktiven und Membran ähnlichen Phospholipiden möglich macht. Die entwickelte Methode wurde mit in der Forschung gängigen Vorhersagemodellen (Oktanol/Wasser Verteilungskoeffizient, Berechung der molekularen Durchschnittsfläche und Parallel Artificial Membran Permeation Assay (Pampa)) verglichen. Hierbei stellte sich heraus, dass keine andere Methode in der Lage ist, eine so präzise Vorhersage für pharmazeutische Wirkstoffe mit unterschiedlichsten chemischen Strukturen und physikalisch-chemisch Eigenschaften zu treffen. Wechselwirkungen des Verhaltens des zweiten Test Sets an der Blut-Hirn-Schranke konnten mit der gleichen Methode, allerdings in abgewandelten physiologischen Puffersystemen, bestimmt werden. Die Kalkulation der SAP-Parameter ergab eine sehr gute lineare Korrelation zwischen der molekularen Durchschnittsfläche an der Wasser-Luft-Grenzfläche von schwerlöslichen Verbindungen und des in vivo gemessenen Blut-Hirn-Verteilungskoeffizienten (log bb). Hierbei konnte festgestellt werden, dass mit steigender Größe der Durchschnittsfläche, welche ein Molekül an der Wasser-Luft Grenzfläche einnimmt, sich die Tendenz, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, verringert. Um die Methode über die verwendeten Versuchssubstanzen der Firma Johnson & Johnson Research and Development, Beerse, Belgien zu bestätigen, wurden die Substanzen Diphenhydramin und Loperamid einbezogen, da deren Verhalten an der Blut-Hirn-Schranke allgemein sehr gut beschrieben ist. Hierbei wurde bewiesen, dass die SAP Methode und die Berechung der molekularen Durchschnittsfläche an der Grenzfläche für die Vorhersage der passiven transzelluläre Resorption an der Blut-Hirn-Schranke geeignet ist. Mit dieser Studie konnte gezeigt werden, dass die SAP-Methode mittels Analyse von Oberflächenspannungsprofilen als aussagekräftiges Vorhersageprinzip für Interaktionen an biologischen Membranen von gut und schlecht wasserlöslichen Substanzen genutzt werden kann. Somit kann die Methode deutlich zur Effizienzsteigerung bei Screening neuer Wirkstoffkandiaten beitragen.

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Metadaten
Author:Anna Christine Petereit
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-228122
Referee:Jennifer B. DressmanGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2011/10/06
Year of first Publication:2011
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2011/09/19
Release Date:2011/10/06
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:307608077
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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