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Wibke Wagner

• Prion-Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Fehlfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in seine pathogene Isoform PrPSc verursacht werden. Welche zellulären Mechanismen an dieser Fehlfaltung oder der Pathogenese beteiligt sind, ist bis heute nur teilweise geklärt. Einerseits wird vermutet, dass z.B. eine toxische cytosolische Form des PrPC aufgrund einer Störung des Proteasoms akkumulieren könnte und spontan in PrPSc umgewandelt wird. Andererseits konnte gezeigt werden, dass viele Signalwege, wie die MAPK-Signalwege am Prozess der Neurodegeneration beteiligt sein könnten. Ziel dieser Arbeit war daher zum einen die Untersuchung der morphologischen Veränderung einer Zelllinie, die cytosolisches PrP exprimiert, und zum anderen die Identifikation weiterer Signalwege, die an der Prionpathogenese beteiligt sein könnten, was mittels Analysen des (Phospho)proteoms Prion-infizierter Zellen und Mäusegehirne durchgeführt werden sollte. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden murine Neuroblastoma Zellen charakterisiert, die eine cytosolische Form des Prion Proteins (CyPrP) exprimierten. Diese Zellen zeigten zwar keine cytotoxischen Merkmale, jedoch wiesen sie dramatische morphologische Veränderungen auf. Weiterhin wurde herausgefunden, dass diese Zellen vermutlich eine Isoform des cytosolischen PrP (CyPrPmod) exprimierten, die sowohl glykosyliert als auch auf der Zelloberfläche verankert war und somit Eigenschaften des Volllängen-PrP aufwies. Die Glykosylierung des CyPrPs wurde in Western Blots nachgewiesen, während die Verankerung des CyPrPs in der Plasmamembran anhand der Durchflusszytometrie untersucht wurde. Der vermutete Zusammenhang zwischen der CyPrPmod-Expression und der morphologischen Veränderung der Zellen wurde mittels Herunterregulation von CyPrP untersucht. Jedoch resultierte dies nicht in der erwarteten Reversion der morphologischen Effekte. Die Wiederholung der stabilen Transfektion in den parentalen N2a Zellen und anderen Zelllinien führte außerdem weder zu einer veränderten Morphologie noch zur Expression von CyPrPmod. Somit sind diese Veränderungen auf unspezifische Prozesse während der ersten stabilen Transfektion der N2a Zellen mit CyPrP zurückzuführen. Um neue Therapien oder Biomarker bei Prion-Erkrankungen zu entwickeln, ist die Untersuchung von Signalwegen, die die Prionpathogenese beeinflussen können, wichtig. Oft werden zelluläre Signalwege über die Phosphorylierung von Proteinen gesteuert, allerdings gab es bisher in der Prionenforschung keine Untersuchungen des Phosphoproteoms von Prion-infizierten Zellen in vivo oder in vitro. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher das Phosphoproteom eines Prionen-replizierenden Zellkultursystems näher untersucht. In einer SILAC-Analyse von nicht infizierten und Prion-infizierten Zellen wurden über 100 Phosphoproteine identifiziert und quantifiziert, von denen drei in Western Blots validiert wurden. Die Phosphorylierung von Stathmin und Cdc2 an spezifischen Phosphorylierungsstellen war in den Prion-infizerten Zellen vermindert, während Cofilin eine erhöhte Phosphorylierung aufwies. Diese Proteine sind an der Regulation des Zellzyklus und des Zytoskeletts beteiligt und könnten eine Rolle in der Prionpathogenese spielen. Außerdem wurde nach 2D-Analysen des Proteoms Prion-infizierter Mäusegehirne eine Hochregulation des antioxidativen Proteins Peroxiredoxin 6 (PRDX6) festgestellt. Auch im Prionen-replizierenden Zellkultursystem konnte dieses Protein in erhöhten Mengen nachgewiesen werden. Experimente zur Unterdrückung bzw. Überexpression von PRDX6 ergaben, dass seine Phospholipase A2-Aktivität Signalkaskaden beeinflussen könnte, die vermutlich die Expression von PrPC und somit die Prion-Replikation regulieren können. Weitere Untersuchungen der PRDX6-abhängigen Signalwege in der Prionpathogenese sowie Inokulationen PRDX6-defizienter Mäuse mit Prionen, könnten erste Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien bei Prion-Erkrankungen sein.
• Prion diseases are neurodegenerative disorders caused by conversion of the cellular prion protein (PrPC) into its pathological isoform PrPSc. The cellular mechanisms leading to this conversion and pathogenicity are not yet fully understood. On the one hand it has been proposed that neuronal death might be triggered by accumulation of a toxic cytosolic form of PrPC due to an impairment of the proteasome followed by spontaneous conversion into PrPSc. On the other hand it has been shown that many signalling pathways including MAPK signalling might be involved in processes leading to neurodegeneration. In the first part of this work murine neuroblastoma cells expressing a cytosolic form of PrPC (CyPrP) were characterized in more detail. These cells didn’t show any cytotoxic effects, but exhibited dramatic morphological alterations. Furthermore, these cells expressed a modified glycosylated isoform of cytosolic PrP (CyPrPmod) at the cell surface and thus displayed characteristics of full length PrP. The correlation of CyPrPmod expression and the morphological changes was investigated by knock down of the CyPrP expression using siRNA, but did not recover the cell morphology. A new stable transfection of CyPrP in N2a or other neuronal cell lines neither led to morphological alteration nor expression of CyPrPmod. Thus, the changes might be caused by unwanted and unspecific events of the first stable transfection. Investgations of cellular signalling pathways involved in prion pathogenesis are important for the development of new therapies or marker molecules in prion diseases. Cellular signalling pathways are often regulated by phosphorylation of proteins, but extensive investigations of the phosphoproteome are lacking so far. Therefore, in the second part of my work a SILAC analysis in a cell culture model for prion infection was used to identify differentially regulated phosphoproteins. The phosphorylation of stathmin and Cdc2, both involved in the regulation of the cell cycle, was reduced at specific sites. The phosphorylation of cofilin, a regulator of cytoskeleton dynamics, was enhanced. These identified proteins might permit further insights in the cellular mechanisms of prion pathogenesis. Furthermore, 2D-analysis and mass spectrometry of the proteome of murine brain identified the upregulated antioxidant protein peroxiredoxin 6 (PRDX6) in scrapie infected individuals. In a scrapie infected cell culture model the level of PRDX6 was increased as well. Interestingly, suppression of PRDX6 resulted in a decreased PrPC expression and PrPSc formation, while overexpression of PRDX6 enhanced expression of PrPC and therefore prion replication. Probably, the level of PRDX6 influences PrPC expression via its phospholipase A2 activity and related signalling pathways. Further investigation of PRDX6-dependent signalling events in prion pathogenesis might represent a first step in the devolpment of new therapies and biomarkers.