Open Access

Kerstin Sander

• Histamin gilt seit seiner Entdeckung vor ungefähr 100 Jahren als ein wichtiger chemischer Botenstoff im Organismus. Der Transmitter vermittelt pleiotrope Effekte über vier bisher bekannte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (H1R-H4R), die in die Regulation vielfältiger physiologischer Funktionen involviert und an der Entstehung von Krankheiten beteiligt sind. Antagonisten der ubiquitär im Organismus exprimierten H1R und H2R werden weitreichend zur Therapie von allergischen Erkrankungen bzw. Geschwüren im Gastrointestinaltrakt eingesetzt. H3R und H4R sind die jüngsten Vertreter der Histamin-Rezeptor-Klasse (HR). Auf molekularer Ebene zeigen diese beiden Subrezeptoren einen hohen Verwandtschaftsgrad. Sie ähneln sich u.a. bezüglich ihrer Aminosäuresequenz, ihrer Struktur und der Bindungseigenschaften von Liganden. Beide sind funktionell an inhibitorische/olfaktorische G-Proteine gekoppelt. Negative Rückkopplungsmechanismen werden durch ein hohes Maß an konstitutiver Aktivität ermöglicht. Dies unterstreicht die modulierende Funktion beider Rezeptoren, die wichtige physiologische Prozesse im Gleichgewicht hält. Als Auto- und als Heterorezeptor kommt der H3R hauptsächlich im zentralen Nervensystem vor. Er kontrolliert die Synthese und Freisetzung seines endogenen Liganden, moduliert aber auch die Konzentration anderer Neurotransmitter im synaptischen Spalt, die aus ko-lokalisierten Neuronen freigesetzt werden. Aus diesem Grund nimmt das neuronale histaminerge System eine entscheidende Rolle in der Erhaltung physiologischer Prozesse, wie z.B. Erregung, Aufmerksamkeit und Ernährungsverhalten, ein. Ein Ungleichgewicht der Neurotransmitterkonzentrationen kann die Entstehung neuronaler Erkrankungen verursachen, z.B. neurodegenerative Erkrankungen, Aufmerksamkeitsstörungen oder Übergewicht. Pitolisant ist der erste inverse H3R-Agonist, der sich in Phase III der klinischen Prüfung befindet. Sein erfolgreicher Einsatz bei verschiedenen pathophysiologischen Zuständen kann als Beweis für das H3R-antagonistische Therapieprinzip angesehen werden. Im Gegensatz zum H3R wird der H4R hauptsächlich in der Peripherie exprimiert, wo er an der Modulation des Immunsystems und an der Entstehung entzündlicher Prozesse beteiligt ist. Ergebnisse aus ersten präklinischen Studien sind teilweise widersprüchlich,weisen aber darauf hin, dass H4R-Liganden potenziell zur Therapie von allergischen und entzündlichen Erkrankungen entwickelt werden könnten. In beiden Forschungsgebieten müssen fundamentale Fragen noch geklärt werden, z.B. die Bedeutung von Rezeptor-Isoformen, die Rolle von Rezeptor-Heterodimeren oder die Aufklärung therapeutischer Prinzipien. Zudem müssen Liganden-Bindundgsmodi charakterisiert werden, um in der Zukunft weitere Bindungsareale in den jeweiligen Bindetaschen optimal zu nutzen. Hierdurch können Affinität, Aktivität und Selektivität von Liganden gesteuert werden. Diese Fragestellungen verdeutlichen den Bedarf an neuen Leitstrukturen und pharmakologischen Werkzeugen, die im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert wurden. Im Vordergrund des H3R-Projektes standen Prinzipien des bioisosteren Austauschs, um dadurch die Entwicklung verschiedener Vorstufen für Liganden zum Einsatz in bildgebenden Verfahren zu ermöglichen. Ziel des H4R-Projektes war die Etablierung einer neuen Leitstruktur sowie deren Modifikation und Optimierung, um eine für die Aufstellung von Struktur-Wirkungsbeziehungen geeignete Substanzbibliothek zu erhalten. Mit Hilfe verschiedener In-vitro- und In-silico-Experimente wurde diese Bibliothek zur Charakterisierung der H4R-Bindetasche herangezogen und kann zukünftig auch in-vivo verwendet werden. Zu Beginn der Arbeit wurde von wenigen bekannten H4R-Liganden ein Pharmakophormodell abgeleitet. In seinen Grundbausteinen zeigte es große Ähnlichkeit zu einem schon etablierten H3R-Antagonist-Modell, was den hohen Verwandtschaftsgrad der Zielstrukturen widerspiegelte und auf überlappende Struktur-Wirkungsbeziehungen hinwies. Für die Synthese der Liganden bedeutete dies, dass präparative Methoden von einem auf das andere Gebiet übertragen werden konnten. Aufgrund des unterschiedlichen Forschungsstandes werden beide Projekte im Folgenden getrennt behandelt. Die Synthese der nötigen Vorstufen zur Darstellung von H3R-Antagonisten/inversen Agonisten wurde mittels im Arbeitskreis evaluierter Methoden durchgeführt. Standardmethoden wie reduktive Aminierungs- oder Amidierungsreaktionen wurden herangezogen, um das 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-H3R-Pharmakophor (1) zu erweitern. Zusätzlich wurden Triazole als alternative verknüpfende Elemente erprobt, um ein zweites basisches Zentrum, das potenziell Nebenwirkungen hervorruft, zu vermeiden. Die Triazole wurden in einem Klick-Chemie-Ansatz mittels 1,3-dipolarer Zykloaddition nach HUISGEN dargestellt. Sowohl die Zyklisierung als auch die Synthese entsprechender Azid-Vorstufen wurden erfolgreich etabliert und für die Synthese von Liganden aminerger Rezeptoren optimiert. Phenyl- und Benzylgruppen wurden mit dem H3R-Pharmakophor 1 verknüpft, um eine strukturelle Basis zu erhalten, die den Vergleich mit weiteren Liganden ermöglicht. Im Folgenden wurden der zentrale Phenylether sowie die Arylreste im rechten Teil des Pharmakophors durch derartige Gruppen ersetzt, die komplexierende Eigenschaften besitzen und damit zur Darstellung von entsprechenden SPECT (dt. Einzelphotonen- Emissions-Tomografie)-Liganden geeignet sind. Der elektronenziehende und sterisch anspruchsvolle Charakter der Trifluormethylgruppen in Verbindungen 8–10 spiegelt sich sowohl in der reduzierten chemischen Aktivität der jeweiligen Edukte als auch in der nur moderaten H3R-Affinität wider. Daher wurden diese Elemente nicht weiter verfolgt. Mit den Ferrocen-Derivaten 11–15 wurden zum ersten Mal metallhaltige H3R-Liganden entworfen. Die pharmakologische Charakterisierung dieser Verbindungen zeigte, dass die Sandwichkomplexe sich hervorragend zum bioisosteren Ersatz der Phenylreste eignen. Die Affinitäten der analogen Verbindungen sind vergleichbar und liegen im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich. Der invers-agonistische Charakter des H3RPharmakophors wurde anhand der Verbindungen 11 und 15 bestätigt. Eine vorläufige invivo-Testung der hochaffinen Diamine 11 und 12 zeigte keine zufriedenstellenden Ergebnisse und muss durch weiterführende Untersuchungen ergänzt werden. Verbindung 15 wurde zur Weiterentwicklung zu einem potenziellen SPECT-Liganden ausgewählt. Die elektronenziehenden Eigenschaften des verknüpfenden Triazols erleichterten die Umkomplexierung des Ferrocens zu einem (Tricarbonyl)rhenium-Derivat, jedoch konnten Probleme bei der Aufreinigung einer nicht-radioaktiv markierten Analogverbindung mit den zur Verfügung stehenden chromatographischen Methoden nicht bewältigt werden. Gleichwohl wurden mit den Ferrocen-Verbindungen wertvolle bioisostere Analoga entsprechender SPECT-Liganden synthetisiert. Die Einführung von polaren Kojisäure-Derivaten stellte einen weiteren Ansatz zur Entwicklung von Liganden mit komplexierenden Eigenschaften dar. Außerdem sollten die Molekülgröße reduziert werden, um die Blut-Hirn-Gängigkeit zu erleichtern, und neue Leitstrukturen mit potenziell neuroprotektiven Eigenschaften entwickelt werden. In einem Nebenprojekt wurden Rac1-Inhibitoren dargestellt, die Kojisäure als zentrales Element aufwiesen. Die hier etablierten Synthesewege wurden zur Darstellung der H3RLiganden genutzt. Trotz erheblicher, für g-Pyranone typischer Nebenreaktionen konnte eine Reihe von H3R-Liganden synthetisiert werden (18–24). Die Affinitäten dieser Verbindungen zeigten eine auf den rechten Teil des H3R-Pharmakophors beschränkte bioisostere Potenz von Kojisäure-Derivaten. Besonders die Diamine aus dieser Serie sind als Leitstrukturen für die Entwicklung neuroprotektiver Liganden geeignet. Die neuen H3R-Liganden enthalten außergewöhnliche strukturelle Elemente, die in dieser Art zum ersten Mal am H3R getestet wurden. Die Ergebnisse aus den Bindungsstudien zeigten Grenzen und Möglichkeiten des bioisosteren Ersatzes im zentralen und im rechten Teil des Pharmakophors. Die Verbindungen sind wertvolle Modellsubstanzen, die zur Charakterisierung von lipophilen und hydrophilen Arealen in der H3R-Bindetasche verwendet werden können, und eignen sich als Leitstrukturen, um neue H3R-Liganden mit verschiedenen pharmakologischen Schwerpunkten zu entwickeln. Basierend auf einem von wenigen Referenzliganden abgeleiteten Pharmakophormodell wurde das H4R-Projekt mit verschiedenen Screening-Verfahren initiiert. In-silico wurde nach Fragmenten und neuen Pharmakophoren gesucht, um diese im Folgenden mit Hilfe von klassischen Verfahren der medizinischen Chemie zu modifizieren und zu optimieren. Innerhalb einer Strukturklasse wurden zunächst nur wenige Verbindungen synthetisiert. Zeigten diese ein unzureichendes Bindungsverhalten, wurde die Entwicklung eingestellt. In einem virtuellen Screening wurden zwei heterozyklische Strukturen mit Affinitäten im niedrigen mikromolekularen Konzentrationsbereich identifiziert, die zur Entwicklung einer Reihe von Aminopyrimidinen führten. Ähnliche Verbindungen wurden zeitgleich zu unserem Projekt von der pharmazeutischen Industrie untersucht und durch weitreichende Patente geschützt. Die neue Leitstruktur, N4-Benzyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)pyrimidin-2,4-diamin (46), wurde umfangreich derivatisiert. Prinzipien wie Heteroatom-Austausch, Rigidisierung und Modifikation des Substitutionsmusters am Benzylring nach TOPLISS wurden angewendet, um das Pharmakophor hinsichtlich Affinität, Funktionalität und Selektivität zu diversifizieren und zu optimieren. Die Synthese der Verbindungen 44–71 erfolgte hauptsächlich unter Mikrowelleneinstrahlung. Da konventionelle präparative Methoden keine Produktbildung ermöglichten, wurde eine sequentielle Mikrowellensynthese etabliert, mit Hilfe derer die gewünschte Umsetzung schnell und in hohen Ausbeuten erzielt wurde. Initialschritte zur Darstellung von Fluoreszenzliganden, die auf dem Aminopyrimidin-Pharmakophor basieren, wurden mit Verbindungen 72–75 erfolgreich realisiert. Bezüglich ihrer H4R-Affinität sollten diese Liganden in Zukunft weiter optimiert werden. Struktur-Wirkungsbeziehungen der Verbindung 46 und entsprechender Derivate zeigten, dass Affinitäten im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich durch die Einführung kleiner, lipophiler benzylischer Substituenten in ortho-Position erreicht werden (z.B. durch 2-Cl- und 2-CH3-Reste in Verbindungen 58 und 59). In Verdrängungsstudien wurde das Bindungsverhalten ausgewählter Verbindungen an anderen HR-Subtypen untersucht. Die Liganden zeigten Selektivität in Bezug auf H1R und H2R und eine Präferenz für den H4R gegenüber H3R. Das 2,6-Dichlor-Derivat 62 stellte eine der potentesten und selektivsten Verbindungen dieser Serie dar. Das Substitutionsmuster des Benzylrestes beeinflusste die Effektivität der Liganden in großem Maße: Ortho- und para-substituierte Verbindungen zeigten in [35S]GTPgS-Bindungsstudien Partialagonismus. Mit steigendem Radius der para-Substituenten wurde eine Verschiebung zum neutralen Antagonismus und zum schwachen inversen Agonismus beobachtet, während meta-Substituenten ausgeprägten inversen Agonismus verursachten. Dieser wurde durch die Rigidisierung der Benzylamin-Gruppierung weiter verstärkt. Verbindung 69 zeigte sogar eine höhere invers agonistische Potenz als der Referenzligand Thioperamid. Um Hinweise auf die strukturellen Voraussetzungen für Agonismus und Antagonismus zu erhalten, wurde eine Moleküldynamiksimulation durchgeführt. Nach der virtuellen Ligandenbindung nahmen der Partialagonist 49 und der inverse Agonist 69 gegensätzliche Bindemodi in der H4R-Bindetasche ein. Die Bindung des inversen Agonisten wurde durch einen scheinbaren „ionic lock“, der hier zum ersten Mal postuliert wurde, stabilisiert. Da in-silico-Experimente von anderen Forschergruppen teilweise gegensätzliche Ergebnisse zeigten, sollten zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden, um zu klären, ob unterschiedliche Bindemodi durch gegensätzlicher Effektivitäten oder verschiedene Pharmakophore hervorgerufen werden. Die Aminopyrimidine stellen exzellente pharmakologische Werkzeuge dar. Die große Diversität bezüglich der Effektivität, die innerhalb einer Strukturklasse vom Partialagonismus bis zum inversen Agonismus reicht, bietet eine geeignete Grundlage, um potenzielle therapeutische Anwendungsbereiche von H4R-Liganden zu untersuchen und zu klären, welche Effekte aus der Aktivierung, Blockade oder Hemmung des H4R resultieren. Klassische Methoden der medizinischen Chemie wurden zur Entwicklung von Liganden zweier eng verwandter Zielstrukturen, H3R und H4R, verwendet. Im H4R-Projekt wurden zusätzlich Computer-gestützte Methoden herangezogen. Die Modifizierung und Optimierung verschiedener Leitstrukturen führte zu der Synthese von 75 Endverbindungen. Das H3R-Projekt, aus dem 22 dieser Verbindungen resultierten, fokussierte auf Prinzipien des Bioisosterismus. Triazole, Ferrocene und Kojisäure-Derivate wurden zum ersten Mal in ein H3R-Pharmakophor integriert. Die Eignung dieser Elemente als bioisosterer Ersatz des zentralen Phenylethers oder der Arylreste im rechten Molekülteil wurde untersucht. Mit dem hieraus gewonnenen Wissen wurden SPECT-Ligand-Vorstufen optimiert. Neue Leitstrukturen mit außergewöhnlichen Elementen stellen zudem Modellsubstanzen dar, die zur anhaltenden Charakterisierung der H3R-Bindetasche dienen. Auf dem H4R-Gebiet gehören die Aminopyrimidine zu einer der am weitesten entwickelten Substanzklassen. Die Derivatisierung der 31 synthetisierten Verbindungen verspricht neue Kenntnisse über diese Stoffklasse. Vor allem inverse Agonisten sollten auf ihre therapeutische Anwendbarkeit als Immunmodulatoren untersucht werden. Eine solche Effektivität könnte strukturell durch die Modifikation der meta-substituierten Aminopyrimidine oder durch die Verzweigung der benzylischen Methylengruppe erreicht werden. Eine ausführliche Charakterisierung der in Bezug auf Affinität und Effektivität vielversprechendsten Derivate, z.B. des 2,6-Dichlor-Derivates 62 oder der inversen Agonisten 68-70, sollte in naher Zukunft durchgeführt werden. Um in-vitro-Daten auf präklinische Tierstudien übertragen zu können, sollten die Liganden zusätzlich an H4Rs unterschiedlicher Arten getestet werden, da Spezies-Unterschiede eine solche Extrapolation derzeit nicht zulassen. Anschließend können die Aminopyrimidine als pharmakologische Werkzeuge in grundlegenden pharmakologischen Experimenten eingesetzt werden, um die Untersuchung der (patho)physiologischen Bedeutung des H4R fortzuführen.
• Since its discovery about 100 years ago HA has been regarded as an important chemical messenger. It mediates its pleiotropic effects via four known class A GPCRs that are involved in the regulation of many physiological functions and in the development of pathophysiological states. Antagonists of the ubiquitously expressed H1R and H2R subtypes have reached blockbuster status in the therapy of allergy and ulcer, respectively. H3R and H4R are the most recently discovered members of the HR family. On molecular level, these subtypes show high relatedness concerning sequence, structure and ligand binding properties, etc. Both H3R and H4R are functionally coupled to a Gai/o protein and show a high amount of constitutive activity allowing for negative feedback mechanisms. The modulating function of both targets ensures important physiological balances. H3R auto- and heteroreceptors preferentially occur in the CNS, where they control the formation and liberation of the endogenous ligand HA and modulate the synaptic concentration of many other neurotransmitters. This reveals the key role of the histaminergic neuronal system in the regulation of physiological processes like arousal, vigilance and feeding behaviour. A neurotransmitter imbalance might cause the development of neuronal diseases, e.g. cognition and sleep/wake disorders, obesity and neuropathic pain. The first H3R inverse agonist in clinical phase III, pitolisant, can be regarded as proof of principle for a successful therapeutic application of H3R ligands. The H4R is mainly expressed on hematopoietic cells. Physiologically and pathophysiologically it is involved in inflammatory responses and the modulation of the immune system. Preliminary preclinical data of the first H4R agonists and antagonists tested for indications like allergy, asthma, skin inflammation and pain are still conflicting. In both fields H3R and H4R research, respectively, fundamental questions are left open for clarification, e.g. the distribution and importance of isoforms, the role of heterodimerization and the elucidation of therapeutic principles, to mention just a few examples. With respect to future drug development it is important to explain the ligand binding modes and to discover additional areas in the respective binding pockets, which might have an impact on ligand affinity, selectivity and efficacy. However, it is necessary to assess each receptor subtype separately due to different stages of pharmacological characterization and ligand development. The depicted ideas reveal a large unmet need for new drug-like compounds and pharmacological tools, which were prepared during this investigation. The H3R project focused on the development of imaging ligand precursors and principles of bioisosteric replacement, whereas the H4R project dealt with the establishment of a new lead structure and the subsequent preparation of an optimized compound library. This was used to characterize the hH4R binding pocket by performing in vitro and in silico experiments and can be applied in vivo in the future. At the beginning of this investigation a H4R ligand blueprint was deduced from a few published compound classes. Its comparison to the well established H3R antagonist pharmacophore showed similar scaffolds and hence, indicated overlapping structureaffinity/efficacy-relationships, which result from the close relationship of the targets. Regarding chemistry, synthetic experiences from one field could be transferred to the other. The synthesis of H3R ligand precursors was performed as evaluated by predecessors in the working group. Standard methods like reductive amination and different kinds of amidation processes were applied to enlarge the 1-(3-phenoxypropyl)piperidine H3R inverse agonist pharmacophore (1). Additionally, 1,2,3-triazoles were introduced to expand the repertoire of linker moieties and to obtain an alternative option for the implementation of a second basic moiety, thereby excluding potentially occurring side effects. Triazole preparation was performed by the HUISGEN 1,3-dipolar cycloaddition via click chemistry. The synthesis pathway of the cyclization as well as the preparation of the respective azide precursors was successfully tested in the H3R field and established in the working group. Especially the synthesis of azide precursors containing aliphatic amines, which are head groups of both H3R and H4R ligands, within the same molecule required certain optimization steps until the procedure could be frequently used in the chemistry of aminergic receptor ligands. A basis of ligands (2–5) was composed starting with the addition of phenyl- and benzylcontaining moieties. These compounds were used as references throughout the study. In principal, ligands were investigated by pursuing two approaches, namely the substitution of the central phenoxy core and the phenyl moiety in the eastern molecule part. The two aryls were systematically replaced by chemical entities that are mainly suitable for imaging ligand development, i.e. complexing agents for the design of SPECT ligands. 3,5-Bis(trifluoromethyl)phenyl-containing precursors exhibited a poor chemical reactivity due to electron withdrawing effects and sterically demanding properties of the trifluoromethyl groups. This was also reflected the pharmacological properties of compounds 8–10. They only showed moderate hH3R affinities leading to the discontinuation of this scaffold. Metal-containing H3R ligands were designed for the first time. A series of ferrocene derivatives (11–15) revealed that the H3R accepts this iron-containing sandwich complex as a bioisoster of the aryl moiety in the eastern molecule part. Analogue phenyl- and ferrocenyl-containing compounds exhibited comparable affinities in the low nanomolar concentration range. Further pharmacological profiling of the organometallic compounds confirmed the inverse agonist efficacy of the H3R pharmacophore but limited central activity of amines 11 and 12 in vivo. Due to the electron withdrawing properties of the triazole compound 15 was chosen to be advanced as potential SPECT ligand. Considering the major difficulty in the purification of a cold rhenium analogue no further work was carried out on this project. Although oral bioavailability is of minor relevance for SPECT ligands, results from the p.o. in vivo screening should be reassessed in other rodent models. Additionally, it appears useful to probe smaller and more polar complexing moieties. The implementation of polar kojic acid derivatives into the H3R pharmacophore was one approach in that direction. The downsizing of the ligands aimed at an enhanced BBB penetration. The g-pyranone scaffold was noted during a side project targeting the preparation of some Rac1 inhibitors and the evaluation of their cardiovascular effects. Kojic acid attracted with combined sequestrating properties and neuroprotective efficacy. Although synthesis went along with numerous side reactions like polymerization or cleavage of the g-pyranone, a small series of compounds (18–24) was prepared. Similarly to ferrocene, kojic acid derivatives were accepted in the eastern part of the H3R pharmacophore but not as replacement of the central core. The overall affinities showed that the bioisosteric potency of kojic acid is limited. Nevertheless, the diamine-containing ligands within this series are novel lead compounds offering some potential for optimization with regard to neuroprotective substances. Ferrocene derivatives are valuable SPECT ligand precursors, although the preparation of an unlabelled SPECT ligand analogue was not achieved with the available tool set. The designed H3R ligands contain exceptional moieties that were tested for H3R interactions for the first time. Binding data revealed limitations and possibilities of bioisosteric phenyl replacement in the central core and in the eastern part of the H3R pharmacophore blueprint. The compounds are valuable model substances to investigate the eastern part of binding pocket with respect to lipophilic and/or hydrophilic binding areas and the corresponding ligand-receptor interactions. H4R ligand design was based on a loose structural blueprint that was deduced from very few reference compounds known at the beginning of this project. In search of new H4R lead structures classical medicinal chemistry was combined with modern molecular modelling strategies. Starting with the preparation of apparently useful scaffolds discovered in diverse screening procedures, including fragment search, ligand-based pharmacophore screening and the application of a pseudoreceptor, various ligands were tested as H4R ligands. Due to insufficient affinities some of them were abandoned, after only very few compounds had been prepared of one respective class. The scaffold modification of two heterocyclic hits from a ligand-based screening led to the discovery of aminopyrimidines as affine hH4R ligands. Structurally related leads were investigated more or less simultaneously to our study by different pharmaceutical companies and protected in broad patent applications. The designated lead structure N4-benzyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)pyrimidine-2,4- diamine (46) was extensively derivatized. Heteroatom exchange, conformational restriction and modification of the benzylic substitution pattern according to TOPLISS were used to optimize the aminopyrimidine scaffold with respect to affinity, selectivity and efficacy. The synthesis of compounds 44–71 was mainly performed under microwave irradiation. While first attempts using conventional preparation procedures did not result in product formation, the microwave-assisted synthesis was adapted to a sequential high throughput procedure producing high yields in a reasonable time. Initial steps to confer the diaminopyrimidine scaffold on H4R fluorescence ligands could be realized with compounds 72–75. In the future, these ligands have to be optimized under consideration of their H4R affinity. Regarding the structure-affinity/efficacy-relationships of compound 46 hH4R binding in the low nanomolar concentration range was mainly achieved by the introduction of small lipophilic benzyl substituents with intermediate electronic properties (e.g. 2-Cl and 2-CH3 in ligands 58 and 59, respectively). Selected compounds showed selectivity over hH1R and hH2R as well as a preference for hH4R versus hH3R binding of 1–1.5 orders of magnitude. 2,6-Dichloro derivative 62 was one of the most potent and selective ligands within this series. The substitution site of the benzyl moiety had a great impact on efficacy: ortho- and para-substituted compounds evoked partial agonism in a [35S]GTPgS binding assay. Para-substituents with increasing molecular radius also led to neutral antagonists and weak inverse agonists. Meta-substituted compounds proved to be strong inverse agonists, whereas rigidification was able to induce inverse agonism beyond the level of reference inverse agonist THIO. A MD simulation was performed with the aim to elucidate the structural requirements of hH4R agonist and antagonist binding. Opposed binding modes for partial agonist 49 and inverse agonist 69 supported the structure-affinity/efficacy-relationships within the reported series of diaminopyrimidines. For the first time a ‘pseudo ionic lock’ of the hH4R could be suggested. However, opposing results from modelling approaches of other research groups require additional investigations to learn whether binding mode changes are more likely to depend on scaffolds or on efficacies. The small aminopyrimidines-containing molecules are excellent model substances. The broad range from partial agonist to inverse agonist efficacies within one class of compounds offers a basis to investigate potential therapeutic applications of H4R ligands and to clarify, which effects result from H4R activation, blockade or inhibition. Classical methods in medicinal chemical were applied to ligand development for two closely related targets, H3R and H4R. In addition, the H4R project was supported by modern computer-aided drug design. Lead structure modification and optimization steps resulted in the preparation of the 75 final compounds. Originating 22, the H3R project focused on principles of bioisosteric replacement. Triazoles, ferrocenes and kojic acid derivatives were for the first time inserted into the H3R inverse agonist pharmacophore blueprint. They were tested as substitutes for the central core and/or the eastern molecule part, respectively, and optimized aiming at the preparation of SPECT ligand precursors. These ligands constitute model substances for the ongoing characterization of the H3R binding pocket and represent new leads with exceptional structural features. In H4R research, the diaminopyrimidines are the broadest developed ligand class. Further derivatization of the reported series of 31 compounds might enhance the knowledge about this scaffold. Following the idea of the scientific community to therapeutically approach inverse H4R agonists such potencies could be enhanced by modification of the meta-substituted ligands or by branching of the methylene spacer in the eastern molecule part. An expanded characterization of the most promising diaminopyrimidines, e.g. 2,6- dichloro derivative 62 or conformationally constrained compounds 68-70, should take place in the near future. Ligands might have to be tested on rodent and canine H4R due to significant species differences that impede the extrapolation of in vitro hH4R data to preclinics and vice versa. Once profiled with respect to animal H4R affinities and efficacies it is suggested to employ selected ligands in basic pharmacological experiments to continue the investigation of the immunomodulatory role of the H4R.