Open Access

Stephanie Peter

• Mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe bieten faszinierende Möglichkeiten hinsichtlich einer zukünftigen therapeutischen Anwendung. Um diese Möglichkeiten genauer zu erkunden, sind noch umfassende Experimente durchzuführen. Die wichtigste Vorraussetzung für diese Experimente ist die Etablierung einer verlässlichen Methode zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus murinem Fettgewebe (mASCs). Die isolierten Zellen müssen charakterisiert werden und es muss der Nachweis geführt werden, dass die isolierten Zellen in vitro in bestimmte Linien differenzieren können. Die Ziele dieser Arbeit waren somit die Etablierung dieser Methode und die Charakterisierung der Zellen. Außerdem wurde die Stabilität der GFP-Expression bei mASCs aus transgenen Mäusen untersucht. Die Erarbeitung eines Standardprotokolls zur Isolierung und Kultur war erfolgreich. Die kultivierten Zellen zeigten die typische Morphologie von mesenchymalen Stammzellen. Die isolierten Zellen wurden durch ein Oberflächenmarkerprofil charakterisiert. Es wurden die in der Literatur beschriebenen charakteristischen CD-Marker untersucht. Durchflusscytometrisch wurde bei den primär isolierten mASC folgende Oberflächenantigene nachgewiesen: CD29+, CD34+, CD44+, CD45-, CD90+, Sca1+. Im Laufe der Kultivierung reduzierte sich die CD34-Expression stark. Dieses Ereignis ist in der Literatur gut beschrieben. Auch die GFP-Expression wurde im FACS untersucht und zeigte sich stabil bis in hohe Passagen. Der Nachweis, dass die isolierten Stammzellen ihr beschriebenes in vitro-Differenzierungspotential besitzen, wurde durch eine Differenzierung in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten belegt. Die mASCs wurden für 3 bzw. 4 Wochen in beschriebenen Medien mit adipogenen, osteogenen oder chondrogenen Supplementen kultiviert. Danach wurden die Zellen gefärbt, um histologisch intrazelluläre Lipidvakuolen bei den Adipozyten, extrazelluläre Knochensubstanz bei den Osteozyten und Glycosaminoglycane bei den Chondrozyten nachzuweisen. Durch revers transkribierte RNA und PCR der so erhaltenen cDNA wurde das Fehlen eines typischen „Stammzell-Genprodukts“, Wnt-4, bei den Adipozyten bzw. Osteozyten nachgewiesen, sowie die Expression von fettspezifischen Genprodukten bei den Adipozyten. Der molekularbiologische Nachweis von knochenspezifischen Genprodukten gelang nicht, die Differenzierung in Osteozyten wurde jedoch durch die histochemische Färbung klar bewiesen. Ein weiteres Ergebnis ist die beobachtete spontane Immortalisierung bei einigen der isolierten Zellpopulationen. Ein mögliches tumorigenes Potential ist im Hinblick auf die zukünftige therapeutische Anwendung von mASCs von großer Bedeutung und bedarf weitere Untersuchungen in vitro und in vivo. Ausblick: Die etablierten mASCs sollen in einem Tierversuch zur Nierenregeneration nach Cisplatin-induzierter akuter Tubulusschädigung zur Anwendung kommen. Es wäre der erste Versuch, in dem murine mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe zur Unterstützung der Nierenregeneration bei Mäusen untersucht werden. Eine Unterstützung der Reparaturvorgänge durch Applikation der optimalen Menge von mASCs zum richtigen Zeitpunkt sowie die Einwanderung von mASCs in die Niere sollen nachgewiesen werden. Nach der induzierten Schädigung werden den Tieren mASCs appliziert, während die Kontrolltiere nur Pufferlösung ohne Stammzellen erhalten. Die Regeneration wird mithilfe der Serumkreatinin-Konzentration im Blut sowie mit histologischen Methoden an Nierenschnitten beurteilt werden. Auch das in vitro-Modell soll weitergeführt werden, um weitere Erkenntnisse zu den Mechanismen der Stammzelldifferenzierung zu erhalten. Vor allem soll eine mögliche Differenzierung von mASCs zu Nierenepithelzellen erforscht werden. Dazu werden die Effekte von renotrophen Faktoren, Wachstumsfaktoren und konditionierten Medien untersucht. Ein Artikel zur Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Richtung der epithelialen Linie wurde von unserer Arbeitsgruppe bereits publiziert (45).
• Mesenchymal stem cells from fat provide various possibilities concerning therapeutic application. To specify these possibilities, numerous experiments are still needed. Regarding these experiments, preparatory work is to be done: a reliable method for isolation of mesenchymal stem cells from murine fat has to be established. The isolated cells must be characterized and differentiation of the cells has to be proved. These were the aims of the dissertation. Beside, we analyzed the stability of GFP-Expression of mASCs obtained from transgenic mice. The development of a protocol of isolation and cultivation was effective. The cells showed the typical morphology of mesenchymal stem cells. The cells were characterized by a pattern of surface antigens. We analyzed typical CD- antigens well known in literature by flow cytometry. The following antigens were detected on mASCs: CD29+, CD34+, CD44+, CD45-, CD90+, Sca-1+. As the cells got older, a substantial decrease of the CD34-expressionwas observed. This incident is well described by other authors. The GFP-Expression appeared stable up to high passages. The differentiation potential of the isolated cells was shown by the differentiation in adipocytes, osteocytes and chondrocytes. mASCs were cultivated for 3 and 4 weeks in medium with adipogenic, osteogenic and chondrogenic supplements. The cells were stained to show intracellular fat vacuoles in adipocytes, extracellular bone mass around osteocytes and sulphated proteoglycans around chondrocytes. Furthermore, RNA was isolated from the differentiated cells. By revers transcription and PCR, we could show the loss of a typical stem cell product, Wnt-4 in adipocytes and osteocytes. We confirmed the expression of fat-specific gene products in adipocytes. Confirmation of the expression of bone-specific gene products failed. But the differentiation of osteocytes was verified by histochemical staining. Another result was the spontaneous immortalization of some of the isolated cell populations. The risk of tumor formation is -regarding therapeutic application of mASCs- of big interest and needs further investigation. Future prospects: The role of the mASCs during organ regeneration must be investigated in an in vivo system. After impairment of the tubular system of the kidney of mice by Cisplatin, we want to prove that the application of mASCs supports improvement of kidney function as well as the immigration of mASCs in the kidney. This would be the first experiment to investigate the role of murine mesenchymal stem cells in renal regeneration of mice. The mASCs will be applied intravenously, whereas control animals will get saline solution without stem cells. The regeneration will be checked by the creatinine concentration in blood as well as by histological preparation of the kidney. Furthermore, we will continue to cultivate stem cells to explore the mechanisms of stem cell differentiation. We particularly want to determine a possible differentiation to kidney epithelial cells. For this purpose we will analyse the effects of renotroph factors, growth factors and conditioned media. A paper concerning differentiation of mesenchymal stem cells to an epithelial cell line was already published (45).