Open Access

Andree Shalabi

• In allen untersuchten Geweben findet sich eine perinukleäre cytoplasmatische NEUROD-Immunreaktion. Diese zeigt vor allem in den peripheren Geweben, die im Dienste des Metabolismus stehen, einen circadianen Rhythmus. Die NEUROD-Ir untersteht in den Verdauungsorganen Pankreas und Duodenum einem circadianen Rhythmus. Das Maximum der NEUROD-Ir liegt in der frühen subjektiven Nacht, zum Zeitpunkt der gesteigerten Nahrungsaufnahme. Möglicherweise reguliert NEUROD als rhythmischer Transkriptionsfaktor die Expression von Genen, die im Dienste des Metabolismus stehen. In Pankreas und Duodenum ist die NEUROD-Ir in MT1-defizienten Mäusen deutlich schwächer ausgeprägt als im WT. Dies deutet darauf hin, dass Melatonin über Aktivierung des MT1-Rezeptors einen modulatorischen, stimulierenden Einfluss auf die Synthese von NEUROD im endokrinen Pankreas und in den Krypten des Duodenums ausübt. Dieser Effekt scheint jedoch indirekt zu sein, da nur eine geringe Kolokalisation der NEUROD- mit der MT1-Ir nachgewiesen werden konnte. Mittels Mehrfachfluoreszenzmarkierung wurde die Identität der NEUROD-Ir Zellen in Pankreas und Duodenum charakterisiert. Es findet sich eine NEUROD-Ir in Glucagon--Zellen), Somatostatin-produzierenden Zellen (δ-Zellen), PP-produzierenden Zellen (γ-Zellen) und Ghrelin-produzierenden Zellen (ε-Zellen). Auch die vom Duodenum bekannten Hormone GIP, PYY und Serotonin sind im adulten endokrinen Pankreas präsent, Serotonin zeigt zudem weitgehende Kolokalisation mit NEUROD. Eine hundertprozentige Kolokalisation besteht in den Langerhans Inseln von Tyrosinhydroxylase und NEUROD. Einige Zellen in den Langerhans Inseln zeigen Koproduktion von PYY und Serotonin sowie PYY und VIP, nicht jedoch von PYY und Glucagon, PYY und Gastrin sowie Glucagon und PP. Des Weiteren ist auch NPY im adulten endokrinen Pankreas nachweisbar. Von den Melatonin-Rezeptoren kommt der MT2-Rezeptor besonders zahlreich in den Langerhans Inseln vor und zeigt teilweise Kolokalisation mit NEUROD, der MT1-Rezeptor ist in den Langerhans Inseln nur vereinzelt nachweisbar. Im exokrinen Pankreas konnten feine Fasern nachgewiesen werden, die eine NEUROD-Ir aufweisen. In den Krypten des adulten Duodenums von Mäusen ist die NEUROD-Ir ebenfalls perinukleär-cytoplasmatisch. Kolokalisation der entsprechenden Hormone mit NEUROD besteht in Gastrin-produzierenden Zellen (G-Zellen) in den Krypten und in der Lamina propria mucosae; in Secretin-produzierenden Zellen (S-Zellen) in den Krypten, in der Lamina propria mucosae sowie in den Zotten; in Substanz P-produzierenden Zellen (P-Zellen) in den Krypten. Letztere Zellen zeigen auch in den Langerhans Inseln des endokrinen Pankreas teilweise Kolokalisation mit NEUROD. Des Weiteren besteht Kolokalisation von GIP und NEUROD in den Inseln des Duodenums. Ghrelin und PP, bekannterweise in den Langerhans Inseln des endokrinen Pankreas vorhanden, werden auch im Duodenum produziert. Ghrelin findet sich zwischen den Krypten wie auch in einzeln identifizierbaren Zellen in den Krypten, die bislang nicht beschrieben wurden und eine hundertprozentige Kolokalisation mit NEUROD aufweisen. PP findet sich im Duodenum in den Krypten, Zotten und Inseln, es besteht keine Kolokalisation mit NEUROD, während in den Langerhans Inseln des endokrinen Pankreas Kolokalisation von PP mit NEUROD gegeben ist. Das deutet darauf hin, dass die Langerhans Inseln des endokrinen Pankreas und die Inseln des Duodenums sich voneinander unterscheiden. Es besteht in den Krypten des adulten Duodenums keine Koproduktion von Substanz P und Serotonin, in den Inseln des adulten Duodenums keine Koproduktion von Serotonin und PYY. Tyrosinhydroxylase ist im adulten Duodenum auβerhalb der Krypten und in den Zotten vorhanden, zeigt aber im Gegensatz zum endokrinen Pankreas hier keine Kolokalisation mit NEUROD. Auch NPY ist im adulten Duodenum nachweisbar, und zwar in den Krypten wie auch in den Zotten. In der Lamina propria mucosae des adulten Duodenums liegen wie im adulten exokrinen Pankreas feine Fasern vor, die auch hier NEUROD-immunpositiv sind. Auch in der hypophysären Pars tuberalis ist die NEUROD-Ir in MT1-defizienten Mäusen geringer ausgeprägt als in WT und nicht rhythmisch. Daher scheint auch in diesem Gewebe Melatonin einen (indirekten) stimulierenden Effekt auf die Synthese von NEUROD zu haben. Dies ist von besonderem Interesse, da die Pars tuberalis der einzige Anteil der Hypophyse ist, der Melatoninrezeptoren enthält und über parakrine Faktoren die jahreszeitliche Hormonsynthese der Pars distalis beeinflussen kann. Diese Arbeit zeigt zum ersten Mal das Vorkommen der Hormone Ghrelin, GIP und Secretin in der Pars tuberalis. GIP ist teilweise mit NEUROD kolokalisiert. Dieser Befund unterstreicht die Rolle der Pars tuberalis für die rhythmische Nahrungsaufnahme. Im Hippocampus (Gyrus dentatus, CA1 und CA3 Region) zeigt die NEUROD-Ir in MT1-defizienten und WT Mäusen ein ähnliches Tagesprofil. Daher scheint das MT1-vermittelte Melatoninsignal keinen Effekt auf die Synthese von NEUROD zu haben. Auch im Neuropil der Eminentia mediana sowie in den Ependymzellen des dritten Ventrikels ist kein eindeutiger Effekt des MT1-Defizits auf die NEUROD-Ir festzustellen. Offenbar wird die Synthese von NEUROD in neuronalen Strukturen, anders als in peripheren Strukturen, nicht über Melatonin (MT1) beeinflusst. Die Rolle des molekularen Uhrwerkes auf die Synthese von NEUROD wurde durch die vergleichende Analyse der NEUROD-Ir in WT und PER1-defizienten Mäusen untersucht. Dabei zeigte sich, dass der negative Regulator PER1 offenbar einen hemmenden Einfluss auf die Synthese von NEUROD in Pankreas und Hippocampus (Gyrus dentatus, CA1 und CA3 Region) ausübt. PER1 hemmt im molekularen Uhrwerk rhythmisch die CLOCK:BMAL1 vermittelte Genexpression. Fehlt PER1, wird auch die Inhibition der Expression von uhrenkontrollierten Genen, deren rhythmische Expression vom molekularen Uhrwerk gesteuert wird, geschwächt. Dadurch kommt es zur Enthemmung der Expression von uhrenkontrollierten Genen und zu einer Steigerung der entsprechenden Proteinsynthese. Die vergleichende Analyse von WT und PER1-defizienten Määusen deutet darauf hin, dass NeuroD ein uhrenkontrolliertes Gen sein könnte. Dies ist insbesonders interessant im Hinblick auf die wichtige Rolle von NEUROD bei der adulten Neurogenese. Im Hippocampus (Gyrus dentatus, CA1 und CA3 Region) findet sich die NEUROD-Ir in Neuronen der Körnerschicht und in der polymorphen Schicht bzw. in Pyramidenzellen. Dabei scheinen besonders unreife Neuronen NEUROD-positiv zu sein. Es besteht teilweise Kolokalisation mit Ghrelin, nicht jedoch mit den Melatonin-Rezeptoren MT1 und MT2. Im mediobasalen Hypothalamus findet sich die NEUROD-Ir im Neuropil von Tractus hypothalamohypophysealis, Zona externa infundibuli sowie in den Ependymzellen des dritten Ventrikels als auch in Neuronen des Nucleus arcuatus. Diese zeigen jedoch keine nukleäre NeuN-Ir. Die Ependymzellen des dritten Ventrikels zeigen nur eine schwache NEUROD-Ir, es besteht keine Kolokalisation von NEUROD mit GFAP. GIP ist, wie oben für die Pars tuberalis beschrieben, in Tractus hypothalamohypophysealis und Zona externa infundibuli vorhanden und zeigt teilweise Kolokalisation mit NEUROD. Secretin ist im mediobasalen Hypothalamus relativ homogen verteilt vorhanden. In Tractus hypothalamohypophysealis, Zona externa infundibuli und Nucleus arcuatus besteht eine starke Ir mit Vimentin, das Fibroblasten, Leukozyten und Endothel-Zellen der Blutgefäβe markiert. Auch die Melatonin-Rezeptoren MT1 und MT2 finden sich in Tractus hypothalamohypophysealis und Zona externa infundibuli. Es besteht jedoch keine Kolokalisation mit NEUROD.
• In all screened tissues the NEUROD immune reaction is perinuclear cytoplasmatic. The immune reaction displays a circadian rhythm primarily in peripheral tissues, which are important for the metabolism. The NEUROD immune reaction follows a circadian rhythm in the following digestive organs: pancreas and duodenum. The maximum of the NEUROD immune reaction occurs in the early stage at night when food intake is high. It is possible that NEUROD functions as a rhythmic transcription factor and regulates the expression of genes that are involved in the metabolism. In the pancreas and the duodenum the NEUROD immune reaction is profoundly weaker in MT1-deficient mice than in WT. This observation indicates that melatonin, by activation of the MT1 receptor, has a stimulatory influence on the synthesis of NEUROD in the endocrine pancreas and in the crypts of the duodenum. The effect seems to be indirect because co-localization of the immune reaction of NEUROD and MT1 is limited. Through multiple fluorescence labeling, it was possible to determine the types of cells in the pancreas and the duodenum that display NEUROD. An immune reaction of NEUROD occurs in cells that produce glucagon s), Somatostatin (δ cells), PP (γ cells) and Ghrelin (ε cells). Hormones produced in the duodenum, such as GIP, PYY and Serotonin, are also produced in the adult endocrine pancreas. In addition, Serotonin is extensively co-localized with NEUROD. There is a one-hundred percent co-localization of Tyrosinhydroxylase and NEUROD in the isles of Langerhans. Some cells in the isles of Langerhans display coproduction of PYY and Serotonin, others display coproduction of PYY and VIP, but there were no cells found that display coproduction of PYY and glucagon, PYY and Gastrin, or Glucagon and PP. Furthermore, NPY has also been detected in the adult endocrine pancreas. Of the melatonin receptors in the isles of Langerhans, the MT2 receptor is most abundant and shows partial co-localization with NEUROD. In contrast, the number of MT1 receptors in the isles of Langerhans contributes only sparsely to the total number of MT receptors found there. In the exocrine pancreas fine fibers have been observed that display an immune reaction of NEUROD. In the crypts of the adult duodenum of mice the immune reaction of NEUROD is perinuclear cytoplasmatic as well. There is a co-localization with NEUROD and hormones in cells that produce Gastrin (G cells) in the crypts and the Lamina propria mucosae; Secretin (S cells) in the crypts, the Lamina propria mucosae and in the villi and Substance P (P cells) in the crypts. Last-mentioned cells display partial co-localization with NEUROD also in the isles of Langerhans in the endocrine pancreas. Further a co-locatization with NEUROD occurs in cells that produce GIP in the islets of the duodenum. Ghrelin and PP, known to be present in the isles of Langerhans in the endocrine pancreas, are also produced in the duodenum. Ghrelin can be found between the crypts as well as in single identified cells in the crypts, which have not been described so far. These cells display one-hundred percent co-localization of Ghrelin and NEUROD. PP can be found in the crypts, villi and islets of the duodenum. A co-localization with NEUROD does not occur, while the isles of Langerhans in the endocrine pancreas display a co-localization of PP with NEUROD. This observation points out that the isles of Langerhans differ from the isles of the duodenum. In the crypts of the duodenum no coproduction of Substance P and Serotonin has been detectable, and there was also no coproduction of Serotonin and PYY in the adult duodenum. Tyrosinhydroxylase in the adult duodenum is present outside the crypts and in the villi. In contrast to the findings of the endocrine pancreas no co-localization of Tyrosinhydroxylase and NEUROD has been observed. NPY is likewise present in the adult duodenum and can be observed in the crypts and in the villi. The Lamina propria mucosae of the adult duodenum displays fine fibers that have been observed in the adult exocrine pancreas. These fibers are NEUROD immune positive here as well. In the hypophyseal Pars tuberalis the NEUROD immune reaction in MT1-deficient mice is also less intense than in WT and non rhythmic. Therefore melatonin seems also in this tissue to have an indirect stimulatory effect on the synthesis of NEUROD. This is of special interest as the Pars tuberalis is the only part of the hypophysis that contains melatonin receptors and that is able to influence the seasonal hormone synthesis of the Pars distalis via paracrine factors. This publication shows for the first time the existence of the hormones Ghrelin, GIP and Secretin in the Pars tuberalis. GIP displays partial co-localization with NEUROD, which emphasizes the role of the Pars tuberalis in rhythmic food administration. In the hippocampus (dentate gyrus, CA1 and CA3) the NEUROD immune reaction follows a similar profile in MT1-deficient mice and WT. Therefore the MT1-mediated melatonin signal seems to have no effect on the synthesis of NEUROD. No effect of the MT1-deficit on the NEUROD immune reaction can be stated for the neuropil of the median eminence or the ependymal cells of the third ventricle. The synthesis of NEUROD in neuronal structures is obviously not influenced by melatonin (MT1), which is different from the peripheral structures. The role of the molecular clock on the synthesis of NEUROD has been screened by comparative analysis of the NEUROD immune reaction and PER1-deficient mice. The negative regulator PER1 has obviously an inhibiting influence on the synthesis of NEUROD in pancreas and hippocampus (dentate gyrus, CA1 and CA3). In the molecular clock PER1 inhibits rhythmically the gene expression mediated by CLOCK:BMAL1. If PER1 is absent, the inhibition of the expression of clock controlled genes, whose rhythmic expression is controlled by the clock, is weakened. In the following a de-inhibition of the expression of the clock controlled genes takes place and protein synthesis is enhanced. The comparative analysis of WT and PER1-deficient mice points out that NeuroD could be a clock controlled gene. This result is of special interest in regard to the important role of NEUROD in adult neurogenesis. In the hippocampus (dentate gyrus, CA1 and CA3) the NEUROD immune reaction is located in neurons of the glia and polymorph layer or pyramidal layer resp. In particular immature neurons seem to be NEUROD positive. A co-localization with NEUROD occurs partially with Ghrelin, but not with the melatonin receptors MT1 and MT2. In the mediobasal hypothalamus the NEUROD immune reaction is localized in the neuropil of the Tractus hypothalamohypophysealis, Zona externa infundibuli, in the ependymal cells of the third ventricle and in neurons of the Nucleus arcuatus. These, however, display no nuclear NeuN immune reaction. The ependymal cells of the third ventricle display only a weak NEUROD immune reaction and no co-localization of GFAP with NEUROD can be reported. GIP is present in the Tractus hypothalamohypophysealis and Zona externa infundibuli and, like in the Pars tuberalis, displays partial co-localization with NEUROD. Secretin is distributed homogenously in the mediobasal hypothalamus. Vimentin displays a strong immune reaction in the Tractus hypothalamohypophysealis, Zona externa infundibuli and Nucleus arcuatus and is known as a marker for fibroblasts, leukocytes and endothelial cells of blood vessels. The melatonin receptors MT1 and MT2 are as well present in the Tractus hypothalamohypophysealis and Zona externa infundibuli. A co-localization with NEUROD, however, has not been observed.