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Marina Maja May

• The NS5B protein of the hepatitis C virus (HCV) is a RNA-dependent RNA polymerase, which is the key enzyme for viral replication. It is recognized as one of the promising targets for antiviral intervention within the new HCV treatment approach of direct-acting antivirals (DAA). However, several of the known non-nucleoside HCV polymerase inhibitors (NNIs) identified by screening approaches show limitations in the coverage of all six major HCV genotypes (GT). Genotypic profiling therefore has to be implemented early in the screening cascade to discover new broadly active NNIs. This implies knowledge of the specific individual biochemical properties of polymerases from all GTs which is to date limited to GT 1 only. The work submitted here gives a comprehensive overview of the biochemical properties of HCV polymerases derived from all major GTs 1 - 6. Biochemical analysis of polymerases from 38 individual sequences revealed that the optima for monovalent cations, pH and temperature were similar between the GTs, whereas significant differences concerning concentration of the preferred cofactor Mg2+ were identified. Implementing the optimal requirements for the polymerases from each individual GT led to significant improvements in their enzymatic activities. However, the specific activity was distributed unequally across the GTs and could be ranked in the following descending order: 1b, 6a > 2a, 3a, 4a, 5a > 1a. Furthermore, the optimized assay conditions for GT profiling were confirmed by testing the inhibitory activity of four known prototype NNIs, each addressing one of the four NNI binding sites. Additionally, a novel NNI chemotype - identified by screening - is described, the substituted N-phenyl-benzenesulphonamides (SPBS). This inhibitor class showed reversible inhibition of NS5B from HCV 1b Con1 with IC50 values up to 39 nM. Based on the decreased inhibitory activity against a recombinant NS5B protein carrying the mutation L419M, it was assumed that the SPBS inhibitors bound to the thumb site II as it has been described for the carboxy thiophene inhibitors. The postulated binding site was consequently confirmed by analysing a provided co-crystal structure of NS5B in complex with a SPBS analogue. Notably, the two SPBS analogues SPBS-1 and SPBS-2 reported here revealed significant differences in addressing the NH-group of the main chain Y477 by hydrogen-bonds, watermediated or directly, which provoked a shift of the carboxyphenyl group of the inhibitors towards the H475 position for the water-mediated binding mode. Interestingly, the differences observed in the binding mode led to a different cross resistance profile at positions M423 and I482. Using the previously optimized biochemical primer-dependent transcription assay, inhibitory activity of the SPBS could be demonstrated against polymerases from HCV GTs 1a and 1b whereas the inhibitor class failed to inhibit any of the non-GT 1 polymerases. Furthermore, initial antiviral activity for SPBS was demonstrated against the subgenomic replicons of HCV GTs 1a and 1b, respectively, and no considerable cytotoxic potential against a panel of ten different cell types. Finally, concerning a possible future treatment without PEG-IFN α or ribavirin, the SPBS analogues were found to display additive to synergistic effects in combination with the benzothiadiazine, the benzofuran and the indole - representative inhibitors for the binding sites palm I, palm II and thumb I, repectively - in the biochemical assay. Within the same binding site as the SPBS, the reference compound hydroxydihydropyranone displayed additive interactions only with the benzothiadiazine (palm I) in the biochemical assay as well as in cell culture. Hence it could be concluded that, having characterized one individual NNI, no universal predication is possible concerning the combinatory behaviour of NNIs binding to the same binding site. As synergistic, antagonistic or additive interactions are inhibitor-dependent (not binding sitedependent) each novel NNI has to be characterized individually in one-to-one combinations.
• Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein einzelsträngiges RNA-Virus der Gattung Hepaciviridae in der Familie der Flaviviren. Es infiziert die humanen Hepatocyten was zu schweren Lebererkrankungen wie chronische Leberentzündung und fortschreitender Leberzirrhose bis hin zu hepatozellulärem Karzinom führen kann. Die Behandlung dieses Virus gestaltet sich als kompliziert. Bedingt durch die fehlende Korrekturlesefähigkeit der viralen Polymerase bei gleichzeitiger Replikationsrate von 1012 Virionen pro Tag entsteht eine hohe Mutationsrate von 10exp3 Nukleotiden pro Generation. Daraus resultierend entwickelten sich mindestens 6 nachgewiesene Genotypen (GT) mit hoher genetischer Variabilität untereinander (31% bis 33 %). Innerhalb der zugehörigen Subtypen beträgt der genetische Unterschied 20% bis 25% [144, 187]. Die derzeitige Standardtherapie von HCV besteht aus dem Immunomodulator pegyliertem Interferon alpha (PEG-IFN α) und dem Nukleosidanalogon Ribavirin. Nachweislich zeigt sie eine unterschiedliche Wirkung bei der Behandlung der einzelnen GT. Während bei Patienten, die mit den HCV GT 2 und 3 infiziert sind, eine 80 %ige Chance besteht, eine nicht mehr nachweisbare Viruslast zu erreichen, sind die Aussichten für Patienten, die mit dem HCV GT 1 infiziert sind, unter 50% [133, 74, 94, 214]. Ungünstigerweise gehört der GT 1 zu den meistverbreiteten GT im europäischen und amerikanischen sowie nord-ostasiatischen Raum [28, 188, 33]. Zusätzlich ist die Standardtherapie mit starken Nebenwirkungen behaftet, die in vielen Fällen zu einem verfrühten Therapieabbruch bis hin zum Suizid führen kann [86]. Um diesen medizinischen Bedarf zu adressieren, soll zumindest das mit stärkeren Nebenwirkungen behaftete PEG-IFN α, wenn möglich aber auch das Ribavirin, ersetzt werden. Zu diesem Zweck fokussiert sich die Forschung auf die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, die gezielt einzelne Enzyme des viralen Replikationszyklus hemmen. Diese Strategie der gezielt hemmenden antiviralen Wirkstoffe (DAA) wurde bereits erfolgreich in der HIV Therapie eingesetzt. Bisher identifiziert wurden antivirale Wirkstoffe gegen die HCV Protease, das NS5A Protein und die HCV Polymerase, wobei die HCV Proteasehemmer Telaprevir (Vertex/Johnson & Johnson/Mitsubishi) und Boceprevir (Merck) kürzlich als erste DAAs für die Behandlung von HCV GT 1 Infektionen zugelassen wurden [177]. Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf die HCV Polymerase und deren mögliche Hemmung. Die auch als NS5B Protein bezeichnete HCV Polymerase ist als RNA-abhängige RNA Polymerase [14] ein Schlüsselenzym der viralen Replikation. Da im menschlichen Körper kein äquivalentes Enzym produziert wird, kann es innerhalb einer Therapie nicht zu einer mechanismusgestützen Fehlinhibierung kommen. Die Inhibitoren der HCV Polymerase werden in nukleosidische (NI) und nicht nukleosidische Inhibitoren (NNI) unterteilt. Die NIs wirken im aktiven Zentrum der Polymerase. Sie fungieren als Nukleosidanaloga und führen durch Konkurrenz mit den natürlichen Ribonukleotidtriphosphaten während der RNA-Replikation zu einem Kettenabbruch. Einen selektiveren Mechanismus weisen die NNIs auf, da sie an für die Polymerase spezifische Bindetaschen außerhalb des aktiven Zentrums binden. Bisher konnten vier allosterische Bindetaschen identifiziert werden. Sie werden nach ihrer Anordnung in der dreidimensionalen Struktur der Polymerase, die einer rechten Hand ähnelt, als „Thumb I“, „Thumb II“, „Palm I“ und „Palm II“ bezeichnet....