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Rajae El Kehal

• Protein translocation across the chloroplast membrane is mediated by molecular machinery composed of protein complexes termed the TOC/TIC (the outer/inner envelope chloroplasts translocases). This translocation process is regulated by metabolic energy in form of GTP and ATP and is influenced by the lipid composition of the membrane. The ability to study the function of a single complex “TOC” in vitro using purified protein or purified chloroplast outer envelope vesicles has been instrumental for our understanding of the mechanism underlying this process. Indeed, the TOC complex has been purified by previously established procedures. However its functional and structural analyses are impaired by the limited yield of purified protein. Therefore, protocols for native TOC complex purification are described here. The complex isolation is achieved by direct biochemical treatment of biological membrane hosting this complex or by tandem affinity purification of modified protein complex components from generated transgenic plants. Furthermore, in this thesis, radioactive based in vitro import assays are described, namely those that allow monitoring translocation activity across the outer envelope of chloroplast. Based on the analysis of knock-out plants and isolated complexes it was previously suggested that lipid dependence of protein translocation might exist. Thus, the question was raised whether the lipid composition of the membrane has a direct influence on the behavior and functionality of the TOC translocon, or whether additional components of the chloroplast membrane account for the observed effect in vivo. To answer this question, a technique for vesicle fusion was developed. The principal aim was to explore the effect of an exchange of the lipid environment surrounding the complex translocon. This method helped to demonstrate that the SQDG and PI act stimulatory on the translocation across the outer envelope of chloroplast, whereas DGDG exhibits an inhibitory effect on TOC complex functionality.
• Die Translokation von Vorstufenproteinen über die Hüll-Membranen von Chloroplasten wird durch einen molekularen Transportapparat getrieben, der aus Protein-Komplexen zusammengesetzt ist. Bei diesen Komplexen handelt es sich um die sogenannten Translokasen TOC / TIC (Translokon an der äußeren bzw. inneren Hüllmembrane von Chloroplasten). Dieser Transportprozess wird durch metabolische Energie in Form von GTP und ATP reguliert und wird auch von der Lipid-Zusammensetzung der Membran beeinflusst. Die Untersuchung der Funktion einzelner TOC-Komponenten oder des gesamten TOC-Komplexes in vitro ist dabei ausschlaggebend für die Beschreibung der zugrunde liegenden Mechanismen dieser Proteintranslocation. In dieser Arbeit wurde die Isolation des TOC-Kernkomplexes weiter optimiert. Bestehende Methoden lieferten nur eine begrenzte Ausbeute des funktionellen gereinigten Komplexes. Aus diesem Grund wurden alternative Protokolle für die native Reinigung des TOC-Komplexes etabliert. Die Isolierung wurde dabei durch bioschemische Behandlung von biologischen Membranen aus Wild-Typ pflanzen und durch Tandem-Affinitätsreinigung von markierten Proteinkomplexen transgenen Pflanzen ermöglicht. Des Weiteren wurde die Regulation des Translokationsprozesses untersucht. Dazu wurde ein auf radioactiv-translatierten Vorstufenproteine basierten in vitro Import-System etabliert, in welchem spezifisch die Funktion der TOC–Translokationsaktivität innerhalb der äußeren Hülle der Chloroplasten analysiert werden kann. Mit diesem System konnte erstmals der Lipideinfluss auf den Translokationsprozess beschrieben werden. Frühere Analysen von A. thaliana Mutanten der synthetizierten Lipide hatten eine solche Abhängigkeit vermuten lassen. Somit entstand die Frage, ob die Zusammensetzung der Membranlipide einen direkten Einfluss auf das Verhalten und die Funktionalität des TOC-Translokons hat. Um diese Frage zu beantworten, wurde eine Technik zur Austausch der Lipid-Umgebung des Komplex Translokon erkundet. Mit dem auf Vesikelfusion basierten System konnte in vitro nachgewiesen werden, dass die Lipide SQDG und PI als Stimulatoren der Translokation über die äußere Hülle von Chloroplasten wirken, während das bisher favorisierte Lipid DGDG nur eine stimulierende Wirkung auf die Anbindung eines der getesteten Vorstufenproteine hatte, wogegen der Import durch dieses Lipid gehemmt wurde.